郭 冶，盛延良，盧鳳美，羅文哲，孟慶媛，殷 悅，劉東璞

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

南北朝醫(yī)家陶弘景有云：“大黃，其色也。將軍之號，當(dāng)取其駿快也?！敝兴幋簏S最早作為瀉下藥，大黃酸是大黃的主要有效成分之一，在抗氧化應(yīng)激中清除超氧陰離子自由基能力最強(qiáng)[1]。盧鳳美等[2]通過探討基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)量的研究結(jié)果顯示，中藥大黃酸聯(lián)合紅景天可抑制肝纖維化的進(jìn)展。肝纖維化是肝臟疾病必經(jīng)的可逆動(dòng)態(tài)病理過程[3-4]，是在炎癥、病毒、寄生蟲等病因作用下引起肝細(xì)胞發(fā)生炎癥及壞死等變化，大量炎癥細(xì)胞趨化聚集，活化靜止的肝星狀細(xì)胞，生成釋放α-SMA的肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失調(diào)，使肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常沉積的病理過程[5-7]。肝纖維化早期階段膠原沉積在竇周間隙內(nèi)皮下，使間隙變小甚至完全消失，進(jìn)而肝竇毛細(xì)血管化，肝細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸受阻，終因缺血、缺氧、變性壞死導(dǎo)致功能障礙[8]；晚期階段(即肝硬化)形成假小葉及結(jié)節(jié)，嚴(yán)重者甚至發(fā)展至肝癌、肝衰竭等，唯一的根治途徑仍是去除有害刺激和肝移植[9]。大黃酸藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示，人體內(nèi)最高安全劑量為600 mg/(kg·d)[10]；也可選擇不同的給藥方式，如口服給藥、保留灌腸給藥等[11]。本研究采用大黃酸經(jīng)口灌胃給藥方式。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 2019年3月選取健康成年SPF級SD雄性大鼠60只，體重180～220 g。由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-0001，使用許可證號：SYXK(黑)2016-014。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核通過。

1.1.2儀器與試劑 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國ABI公司，型號：7300)、PCR儀/基因擴(kuò)增儀(美國ABI公司，SimpliAmp)、瓊脂糖水平(核酸)電泳儀(中國北京六一，型號：DYCP-31CN)、Gel Doc XRTM凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司，型號：Universal Hood Ⅱ)、-80 ℃超低溫冰箱(日本SANYO，MDF-U32V)等。大黃酸購于江蘇省淮安市巍偉植化研究所，秋水仙堿(國藥準(zhǔn)字H20113208)購于廣東彼迪藥業(yè)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購于FOREGENE公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物飼養(yǎng)及分組 將60只大鼠飼養(yǎng)于避強(qiáng)光照、僻靜、室溫(22±2)℃、相對濕度(55±5)%條件下，在遵從大鼠正常生物鐘的前提下標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，自由飲水，科學(xué)觀察3 d后采用完全隨機(jī)抽樣法分為空白對照組(N組)、四氯化碳(CCl4)模型組(M組)、秋水仙堿組(C組)、大黃酸低劑量組(RL組)和大黃酸高劑量組(RH組)。每組12只。

1.2.2肝纖維化模型創(chuàng)建及給藥 肝纖維化模型制備：M、C、RL、RH組大鼠腹腔注射40%CCl4與花生油混合物3 mL/kg，每周2次。N組大鼠腹腔注射等體積花生油。造模3周后C組大鼠給予秋水仙堿，劑量為0.2 mg/kg灌胃，RL、RH組大鼠給予大黃酸，劑量分別為50.0、100.0 mg/kg，上述藥品溶于生理鹽水中，形成的混懸液給予灌胃，N、M組大鼠給予等體積生理鹽水，每周3次，共灌胃4周。

1.2.3RT-PCR檢測肝臟α-SMA、MMP-13及金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)mRNA表達(dá) 按RT-PCR試劑盒從肝臟中提取總RNA，再以此為模板合成cDNA，再進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行RT-PCR，通過觀察循環(huán)數(shù)(Ct)值，計(jì)算2-ΔΔCt值進(jìn)行靶基因細(xì)胞因子定量分析。引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成，引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 引物設(shè)計(jì)

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肝臟病理學(xué)檢查結(jié)果比較 N組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)排列整齊，肝細(xì)胞形態(tài)正常；與N組比較，M組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉間大量纖維膠原組織增生，較寬，延伸入小葉間，有少量形成完整假小葉間隔，肝條索間隙增寬，伴肝細(xì)胞脂肪變及氣球樣變；與M組比較，C、RL、RH組大鼠纖維結(jié)締組織明顯減少，其中RH組大鼠纖維化程度最輕。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟病理學(xué)檢查結(jié)果比較(蘇木精-伊紅染色，200×)

2.2各組大鼠肝臟α-SMA、MMP-13及TIMP-1 mRNA表達(dá)情況比較 與N組比較，RH、C、RL、M組大鼠肝臟α-SMA、TIMP-1 mRNA表達(dá)量逐漸升高，MMP-13 mRNA表達(dá)量逐漸降低，且RH、C、RL、M組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝臟α-SMA、MMP-13及TIMP-1 mRNA表達(dá)情況比較

3 討 論

大黃酸作為一種天然自噬調(diào)節(jié)因子，可通過調(diào)節(jié)AMP依賴的蛋白激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號途徑有效抑制腎小管細(xì)胞自噬活性[12]；通過轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)/Smad蛋白和Wnt/β-聯(lián)蛋白信號通路顯著降低腎細(xì)胞中TGF-β引起的克洛索基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，從而起到抗腎纖維化作用[13]。大黃酸在治療慢性移植腎腎病時(shí)肝細(xì)胞生長因子及骨形態(tài)發(fā)生蛋白表達(dá)明顯升高，且移植腎組織間質(zhì)纖維化減輕[14]。TAN等[15]研究表明，大黃酸能顯著抑制腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1和p38絲裂原活化蛋白激酶活化，減少纖維連接蛋白的生成和分泌，進(jìn)而減少細(xì)胞外基質(zhì)合成而抑制纖維化的發(fā)生，從而達(dá)到防治糖尿病腎病的作用。大黃酸抑制微小RNA-21及干預(yù)TGF-β1/Smad7通路的研究證實(shí)，其具有抗肺纖維化的作用[16]。GUO等[17]通過CCl4造模大鼠肝纖維化后檢測TGF-β1和α-SMA的表達(dá)，給予大黃酸高、低劑量，從大黃酸抗炎、抗氧化及抑制肝星狀細(xì)胞活化，以及抑制TGF-β1作用等可能相關(guān)角度考慮，從而驗(yàn)證了大黃酸抗肝纖維化的作用。血小板衍生生長因子-D未能增加α-SMA的產(chǎn)生，具有上調(diào)TIMP-1表達(dá)的能力[18]。γ-干擾素、腫瘤壞死因子α和表皮生長因子均能通過刺激Smad7蛋白表達(dá)而抑制TGF-β/Smad誘導(dǎo)的包括肝纖維化的反應(yīng)[19]。TSANG等[20]發(fā)現(xiàn)，SHh/GLI1信號傳導(dǎo)是TGF-β依賴性纖維發(fā)生過程中核因子κB的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，是因?yàn)檎{(diào)節(jié)胰腺星狀細(xì)胞活化和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的中心信號級聯(lián)反應(yīng)。

本研究通過腹腔注射CCl4成功制作了肝纖維化大鼠模型，經(jīng)藥物干預(yù)后結(jié)果顯示，M組大鼠肝臟α-SMA、TIMP-1 mRNA表達(dá)量較N組明顯升高，與大鼠肝纖維化程度呈正相關(guān)，RH組大鼠肝臟α-SMA、TIMP-1 mRNA表達(dá)量相對少于M組；RH組大鼠肝臟MMP-13 mRNA表達(dá)量最高，肝纖維化程度相對較輕，與大鼠肝纖維化程度呈負(fù)相關(guān)。截至目前，大黃酸已是治療多臟器纖維化的選用藥物之一，本研究再次表明，肝臟可能成為大黃酸抗纖維化作用的再一個(gè)靶標(biāo)。