張 弦，蔣道榮，張海峰，朱雪娟，張 彬

(南通大學附屬醫(yī)院感染性疾病科，江蘇 南通 226001)

細胞凋亡是急性肝衰竭時肝細胞死亡的主要形式之一[1-2]。細胞凋亡信號傳導途徑是調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵。迄今為止，對急性肝衰竭時肝細胞發(fā)生大量凋亡的信號傳導機制尚缺乏充分的認識。

細胞Toll樣受體4(TLR4)主要識別革蘭陰性菌胞壁成分脂多糖(LPS)。正常肝細胞膜表達TLR4，在急性肝衰竭小鼠肝細胞膜TLR4的表達明顯升高[3]。與細胞凋亡有關(guān)的信號傳導通路中磷酸肌醇-3激酶(PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)通路是重要的介導細胞存活的信號通路，可通過介導多種生物學效應而發(fā)揮抗凋亡作用[4]。AKT激活后主要通過促進糖原合酶激酶3β(GSK3β)等下游底物的磷酸化而發(fā)揮廣泛的生物學效應[5]。TLR4介導的PI3K/AKT/GSK3β信號通路參與了肝細胞凋亡過程。本研究采用LPS作為TLR4的配體，體外刺激大鼠肝BRL-3A細胞制備肝細胞凋亡模型，探討了苦參素(OMT)聯(lián)合復方茵陳顆粒(FYK)是否可通過TLR4介導的 PI3K/AKT/GSK3β 信號通路抑制大鼠肝BRL-3A細胞凋亡，旨在為TLR4介導的信號通路在急性肝衰竭時肝細胞凋亡方面的作用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 大鼠肝BRL-3A 細胞株由中科院細胞庫(上海)提供。

1.1.2試劑 LPS 購自Sigma公司。OMT(純度大于 98%)購自陜西寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司。FYK 3個組分(茵陳、丹參、大黃)顆粒劑購自江陰天江藥業(yè)有限公司。TLR4抗體購自美國NOVUS公司。AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9、Bax、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)及活性-半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)抗體均購自美國Abcam公司。細胞凋亡檢測試劑盒購自Biouniquer公司。Kit-8 細胞計數(shù)(CCK-8)試劑盒購自日本Dojindo實驗室。聚合酶鏈反應(PCR)引物由上海RQ生物公司合成?？俁NA提取試劑及相關(guān)PCR試劑均購自TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1制備FYK及藥物血清 FYK中茵陳、丹參、大黃按2∶1∶1比例臨用時用雙蒸水配制，應用FYK小、中、大3個劑量，比例分別為1∶2∶4，中劑量相當于臨床應用劑量。將30只SD大鼠隨機分為FYK低[3 g/(kg·d)]、中[6 g/(kg·d)]、高[12 g/(kg·d)]劑量組，灌服相應劑量藥物3 d，于末次灌藥后1 h腹腔靜脈采血，靜置凝固，2 500 r/min離心20 min，分離血清，56 ℃滅活30 min，0.22 μm 濾膜過濾除菌，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2大鼠肝BRL-3A細胞培養(yǎng)與傳代 大鼠肝BRL-3A細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的杜氏改良Eagle培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5%二氧化碳。細胞覆蓋率達80%～90%則可用于實驗。傳代時以1×106mL-1的密度，根據(jù)實驗需接種在0.01%多聚賴氨酸包被過的6孔板中，每孔再加入1.0～1.5 mL完全培養(yǎng)基。置培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)。

1.2.3肝細胞凋亡模型創(chuàng)建與分組 分為對照組、LPS組、OMT+LPS組、OMT聯(lián)合FYK低劑量(OMT+FYK-L+LPS)組、OMT聯(lián)合FYK中劑量(OMT+FYK-M+LPS)組和OMT聯(lián)合FYK高劑量(OMT+FYK-H+LPS)組。對照組大鼠肝BRL-3A細胞不處理。LPS組大鼠肝BRL-3A細胞培養(yǎng)24 h后更換含LPS(10 μg/mL)的培養(yǎng)基誘導建立肝細胞凋亡模型。OMT+LPS組大鼠肝BRL-3A細胞培養(yǎng)24 h后給予OMT(3.0 g/L)預處理2 h，再用LPS刺激24 h。OMT+FYK-L+LPS組、OMT+FYK-M+LPS組和OMT+FYK-H+LPS組大鼠肝BRL-3A細胞分別給予OMT(3.0 g/L)及FYK低、中、高劑量的藥物血清預處理2 h后再用LPS刺激24 h。

1.2.4CCK-8法測定大鼠肝BRL-3A細胞活力 調(diào)整 BRL-3A細胞密度為 1×104mL-1，接種于96孔培養(yǎng)板中，孵育24 h后采用CCK-8法檢測各組大鼠肝BRL-3A細胞活力。吸棄舊培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8溶液和90 μL的無血清培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后終止培養(yǎng)，采用多功能酶標儀測定各孔吸光度值。采取雙波長測定，檢測450 nm處吸光度值。參比波長為600 nm。實驗重復5次。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測大鼠肝BRL-3A細胞凋亡率 吸出每孔的培養(yǎng)液至 2 mL 的離心管，用預冷的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)輕輕沖洗細胞板。胰酶消化，加入 0.5 mL 相對應孔收集的培養(yǎng)液終止消化，小心吹打后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 離心管。500 r/min離心5 min，棄上清液。加入 PBS 洗去殘留胰酶。500 r/min離心5 min，棄上清液。加入 250 μL PBS重懸細胞。加入 2.5 μL Annexin V-FITC 后輕輕混勻。室溫避光孵育 10 min。500 r/min離心5 min，棄上清液。加入 250 μL PBS輕輕重懸細胞。加入 2.5 μL 碘化丙啶(PI)輕輕混勻，冰浴避光放置。采用流式細胞儀檢測各組大鼠肝 BRL-3A 細胞凋亡率(1 h內(nèi))。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡(Western-blot)法檢測TLR4、AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9蛋白表達 提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入對應的一抗孵育，置于4 ℃冰箱過夜，用PBS洗3次后加入二抗孵育2 h，再用PBS洗3次后將A、B顯影液按1∶1 比例配制，滴加到膜上，采用ChemiDox XRS 型凝膠電化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯影。Western-blot結(jié)果均重復3次，掃描成灰度照片后應用Image J軟件分析各組大鼠肝 BRL-3A 細胞條帶灰度值。以磷酸化目的蛋白與總目的蛋白灰度值之比表示目的蛋白相對表達量。

1.2.7逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR法檢測抑制TLR4/PI3K/AKT/GSK3β通路后Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表達 實驗重復 3 次，吸去6孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用 PBS 清洗1次，迅速加入預冷的總RNA提取試劑 1 mL，逐步提取總RNA。采用Eppendorf核酸蛋白分析儀進行RNA定量。按說明書操作進行RNA逆轉(zhuǎn)錄，并進行RT-PCR反應。引物：R-caspase-3-F，5′-GGACTGCGGTATTGAGACAGAC-3′；R-caspase-3-R，5′-CCTTCCGGTTAACACGAGTGA-3′；R-Bax-F，5′-CACCAAGAAGCTGAGCGAGT-3′；R-Bax-R，5′-AAGTTGCCGTCTGCAAACAT-3′；R-Bcl-2-F，5′-TGGTGGACAACATCGCTCT-3′；R-Bcl-2-R，5′-CA GCCAGGAGAAATCAAACAG-3′；R-beta-actin-F，5′-AGTGTGACGTTGACATCCGTAA-3′；R-beta-actin-R，5′-GGACAGTGAGGCCAGGATAGA-3′。RT-PCR 檢測結(jié)果用循環(huán)數(shù)(Ct)值表示，相對定量應用比較Ct法，即2-ΔΔCt法。所有數(shù)據(jù)均重復3次。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肝BRL-3A細胞活力比較 與對照組比較，LPS組大鼠肝BRL-3A細胞活力明顯下降，與LPS組比較，OMT+LPS組大鼠肝BRL-3A細胞活力明顯增加，與OMT+LPS組比較，OMT+FYK-H+LPS組大鼠肝BRL-3A細胞活力進一步提高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

與對照組比較，aP<0.05；與 LPS 組，bP<0.05；與 OMT+LPS組，cP<0.05。

2.2各組大鼠肝BRL-3A細胞凋亡率比較 與對照組[(16.34±2.12)%]比較，LPS組大鼠肝BRL-3A細胞凋亡率[(68.72±7.52)%]明顯升高，與LPS組比較，OMT+LPS組大鼠肝BRL-3A細胞凋亡率[(51.42±3.65)%]有所降低，與OMT+LPS組比較，OMT+FYK-H+LPS組大鼠肝BRL-3A細胞凋亡率[(31.36±3.06)%]進一步降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3各組大鼠肝BRL-3A細胞TLR4、AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9蛋白表達比較 LPS組大鼠肝BRL-3A細胞TLR4表達明顯增加，AKT、GSK3β磷酸化蛋白表達明顯下調(diào)。與LPS組比較，OMT明顯下調(diào)TLR4的表達，明顯上調(diào)P-AKTSer473/AKT、P-GSK3βSer9/GSK3β的表達，與OMT+LPS組比較，OMT+FYK中、高劑量明顯下調(diào)TLR4的表達，明顯上調(diào)P-GSK3βSer9/GSK3β的表達，OMT+FYK高劑量明顯上調(diào)P-AKTSer473/AKT的表達，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

與對照組比較，aP<0.05；與LPS組，bP<0.05；與OMT+LPS組，cP<0.05。

2.4各組大鼠肝BRL-3A細胞Bax/Bcl-2、活性-caspase-3 mRNA表達水平比較 與對照組比較，LPS組Bax/Bcl-2、活性-caspase-3 mRNA表達明顯增高，OMT能降低Bax/Bcl-2、活性-caspase-3 mRNA表達水平，聯(lián)合FYK預處理可進一步下調(diào)Bax/Bcl-2、活性-caspase-3 mRNA的表達，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

與對照組比較，aP<0.05；與 LPS 組，bP<0.05；與 OMT+LPS組，cP<0.05。

3 討 論

急性肝衰竭時肝細胞大量死亡，在此過程中肝細胞凋亡是最重要的分子機制[6-8]。本研究測定了OMT 聯(lián)合FYK 低、中、高劑量的藥物血清對大鼠肝BRL-3A細胞活力的影響，結(jié)果顯示，LPS能引起大鼠肝BRL-3A細胞活力明顯下降，OMT聯(lián)合FYK預處理能提高大鼠肝BRL-3A細胞活力。本研究流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，LPS組大鼠肝BRL-3A細胞凋亡率明顯增加，OMT預處理后大鼠肝BRL-3A細胞凋亡率降低，OMT聯(lián)合FYK預處理后大鼠肝BRL-3A細胞凋亡率進一步降低。提示LPS可誘導刺激引起B(yǎng)RL-3A細胞凋亡，OMT聯(lián)合FYK能抑制LPS誘導的大鼠肝BRL-3A細胞凋亡。

細胞凋亡是一個瀑布式的基因表達結(jié)果，在其發(fā)生與調(diào)控過程中有許多基因產(chǎn)物的參與，PI3K/AKT 信號傳導途徑通過對凋亡相關(guān)基因的調(diào)節(jié)作用，在凋亡的發(fā)生與調(diào)控過程中發(fā)揮了重要的生物學功能[9-11]。磷酸化的AKT使GSK3β在絲氨酸Ser9位點上發(fā)生磷酸化，從而抑制GSK3β的活性，發(fā)揮抗凋亡作用[11]。TLR4介導的信號通路也參與了肝細胞凋亡過程，本研究采用LPS刺激大鼠肝BRL-3A細胞，建立了肝細胞凋亡模型，采用Western-blot法檢測 了經(jīng)LPS刺激后TLR4/PI3K/AKT/GSK3β通路相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果顯示，LPS刺激增加TLR4蛋白水平，降低了P-AKTSer473、P-GSK3βSer9水平，OMT可削弱LPS的作用，OMT聯(lián)合FYK預處理進一步削弱了LPS誘導引起的TLR4水平增加，以及P-AKTSer473、P-GSK3βSer9水平下調(diào)。LPS處理顯著增加了肝細胞TLR4表達和PI3K/AKT/GSK3β激活，而OMT+FYK抑制了LPS誘導的侵襲和GSK3β、AKT的磷酸化。提示OMT聯(lián)合FYK可通過TLR4/PI3K/AKT/GSK3β信號通路發(fā)揮抗凋亡作用，保護肝細胞。

Bcl-2 家族是PI3K/AKT信號通路的下游底物，其中Bcl-2(抗凋亡基因)和Bax(促凋亡基因)在體內(nèi)組成一個平衡體系，共同調(diào)控細胞凋亡，在急性肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。caspase-3是細胞凋亡執(zhí)行器，也是凋亡蛋白酶反應的必經(jīng)之路[12-14]。LPS刺激后大鼠肝BRL-3A細胞Bax、活性-caspase-3表達明顯增加，Bcl-2表達降低，OMT可降低LPS的作用，OMT聯(lián)合FYK可使Bax、活性-caspase-3表達進一步降低，Bcl-2表達進一步增加，抗凋亡基因表達占優(yōu)勢，從而發(fā)揮肝細胞保護作用。

綜上所述，LPS刺激后通過激活BRL-3A細胞TLR4，使TLR4表達增加，降低AKT、GSK3β 磷酸化水平，從而使Bax/Bcl-2比例和活性-caspase-3 mRNA表達增加，促凋亡因素占優(yōu)勢，促進大鼠肝BRL-3A細胞凋亡。OMT通過抑制大鼠肝BRL-3A細胞TLR4的表達，使TLR4表達下降，上調(diào) AKT、GSK3β磷酸化水平，從而使Bax/Bcl-2比例和活性-caspase-3 mRNA表達減少，OMT聯(lián)合FYK可進一步加強OMT的作用，從而顯著抑制大鼠肝BRL-3A細胞凋亡，表明OMT聯(lián)合FYK可通過 TLR4/PI3K/AKT/GSK3β信號通路抑制大鼠肝BRL-3A細胞凋亡。