張 弦，蔣道榮，張海峰，朱雪娟，張 彬

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院感染性疾病科，江蘇 南通 226001)

細(xì)胞凋亡是急性肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞死亡的主要形式之一[1-2]。細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵。迄今為止，對(duì)急性肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞發(fā)生大量凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚缺乏充分的認(rèn)識(shí)。

細(xì)胞Toll樣受體4(TLR4)主要識(shí)別革蘭陰性菌胞壁成分脂多糖(LPS)。正常肝細(xì)胞膜表達(dá)TLR4，在急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞膜TLR4的表達(dá)明顯升高[3]。與細(xì)胞凋亡有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路中磷酸肌醇-3激酶(PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)通路是重要的介導(dǎo)細(xì)胞存活的信號(hào)通路，可通過(guò)介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)而發(fā)揮抗凋亡作用[4]。AKT激活后主要通過(guò)促進(jìn)糖原合酶激酶3β(GSK3β)等下游底物的磷酸化而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[5]。TLR4介導(dǎo)的PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路參與了肝細(xì)胞凋亡過(guò)程。本研究采用LPS作為T(mén)LR4的配體，體外刺激大鼠肝BRL-3A細(xì)胞制備肝細(xì)胞凋亡模型，探討了苦參素(OMT)聯(lián)合復(fù)方茵陳顆粒(FYK)是否可通過(guò)TLR4介導(dǎo)的 PI3K/AKT/GSK3β 信號(hào)通路抑制大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡，旨在為T(mén)LR4介導(dǎo)的信號(hào)通路在急性肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞凋亡方面的作用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 大鼠肝BRL-3A 細(xì)胞株由中科院細(xì)胞庫(kù)(上海)提供。

1.1.2試劑 LPS 購(gòu)自Sigma公司。OMT(純度大于 98%)購(gòu)自陜西寶雞市方晟生物開(kāi)發(fā)有限公司。FYK 3個(gè)組分(茵陳、丹參、大黃)顆粒劑購(gòu)自江陰天江藥業(yè)有限公司。TLR4抗體購(gòu)自美國(guó)NOVUS公司。AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9、Bax、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)及活性-半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Biouniquer公司。Kit-8 細(xì)胞計(jì)數(shù)(CCK-8)試劑盒購(gòu)自日本Dojindo實(shí)驗(yàn)室。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物由上海RQ生物公司合成。總RNA提取試劑及相關(guān)PCR試劑均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1制備FYK及藥物血清 FYK中茵陳、丹參、大黃按2∶1∶1比例臨用時(shí)用雙蒸水配制，應(yīng)用FYK小、中、大3個(gè)劑量，比例分別為1∶2∶4，中劑量相當(dāng)于臨床應(yīng)用劑量。將30只SD大鼠隨機(jī)分為FYK低[3 g/(kg·d)]、中[6 g/(kg·d)]、高[12 g/(kg·d)]劑量組，灌服相應(yīng)劑量藥物3 d，于末次灌藥后1 h腹腔靜脈采血，靜置凝固，2 500 r/min離心20 min，分離血清，56 ℃滅活30 min，0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2大鼠肝BRL-3A細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 大鼠肝BRL-3A細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的杜氏改良Eagle培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5%二氧化碳。細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%～90%則可用于實(shí)驗(yàn)。傳代時(shí)以1×106mL-1的密度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需接種在0.01%多聚賴(lài)氨酸包被過(guò)的6孔板中，每孔再加入1.0～1.5 mL完全培養(yǎng)基。置培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)。

1.2.3肝細(xì)胞凋亡模型創(chuàng)建與分組 分為對(duì)照組、LPS組、OMT+LPS組、OMT聯(lián)合FYK低劑量(OMT+FYK-L+LPS)組、OMT聯(lián)合FYK中劑量(OMT+FYK-M+LPS)組和OMT聯(lián)合FYK高劑量(OMT+FYK-H+LPS)組。對(duì)照組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞不處理。LPS組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞培養(yǎng)24 h后更換含LPS(10 μg/mL)的培養(yǎng)基誘導(dǎo)建立肝細(xì)胞凋亡模型。OMT+LPS組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞培養(yǎng)24 h后給予OMT(3.0 g/L)預(yù)處理2 h，再用LPS刺激24 h。OMT+FYK-L+LPS組、OMT+FYK-M+LPS組和OMT+FYK-H+LPS組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞分別給予OMT(3.0 g/L)及FYK低、中、高劑量的藥物血清預(yù)處理2 h后再用LPS刺激24 h。

1.2.4CCK-8法測(cè)定大鼠肝BRL-3A細(xì)胞活力 調(diào)整 BRL-3A細(xì)胞密度為 1×104mL-1，接種于96孔培養(yǎng)板中，孵育24 h后采用CCK-8法檢測(cè)各組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞活力。吸棄舊培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8溶液和90 μL的無(wú)血清培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后終止培養(yǎng)，采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值。采取雙波長(zhǎng)測(cè)定，檢測(cè)450 nm處吸光度值。參比波長(zhǎng)為600 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡率 吸出每孔的培養(yǎng)液至 2 mL 的離心管，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)輕輕沖洗細(xì)胞板。胰酶消化，加入 0.5 mL 相對(duì)應(yīng)孔收集的培養(yǎng)液終止消化，小心吹打后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 離心管。500 r/min離心5 min，棄上清液。加入 PBS 洗去殘留胰酶。500 r/min離心5 min，棄上清液。加入 250 μL PBS重懸細(xì)胞。加入 2.5 μL Annexin V-FITC 后輕輕混勻。室溫避光孵育 10 min。500 r/min離心5 min，棄上清液。加入 250 μL PBS輕輕重懸細(xì)胞。加入 2.5 μL 碘化丙啶(PI)輕輕混勻，冰浴避光放置。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠肝 BRL-3A 細(xì)胞凋亡率(1 h內(nèi))。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡(Western-blot)法檢測(cè)TLR4、AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入對(duì)應(yīng)的一抗孵育，置于4 ℃冰箱過(guò)夜，用PBS洗3次后加入二抗孵育2 h，再用PBS洗3次后將A、B顯影液按1∶1 比例配制，滴加到膜上，采用ChemiDox XRS 型凝膠電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影。Western-blot結(jié)果均重復(fù)3次，掃描成灰度照片后應(yīng)用Image J軟件分析各組大鼠肝 BRL-3A 細(xì)胞條帶灰度值。以磷酸化目的蛋白與總目的蛋白灰度值之比表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR法檢測(cè)抑制TLR4/PI3K/AKT/GSK3β通路后Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表達(dá) 實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，吸去6孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用 PBS 清洗1次，迅速加入預(yù)冷的總RNA提取試劑 1 mL，逐步提取總RNA。采用Eppendorf核酸蛋白分析儀進(jìn)行RNA定量。按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。引物：R-caspase-3-F，5′-GGACTGCGGTATTGAGACAGAC-3′；R-caspase-3-R，5′-CCTTCCGGTTAACACGAGTGA-3′；R-Bax-F，5′-CACCAAGAAGCTGAGCGAGT-3′；R-Bax-R，5′-AAGTTGCCGTCTGCAAACAT-3′；R-Bcl-2-F，5′-TGGTGGACAACATCGCTCT-3′；R-Bcl-2-R，5′-CA GCCAGGAGAAATCAAACAG-3′；R-beta-actin-F，5′-AGTGTGACGTTGACATCCGTAA-3′；R-beta-actin-R，5′-GGACAGTGAGGCCAGGATAGA-3′。RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果用循環(huán)數(shù)(Ct)值表示，相對(duì)定量應(yīng)用比較Ct法，即2-ΔΔCt法。所有數(shù)據(jù)均重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞活力比較 與對(duì)照組比較，LPS組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞活力明顯下降，與LPS組比較，OMT+LPS組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞活力明顯增加，與OMT+LPS組比較，OMT+FYK-H+LPS組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞活力進(jìn)一步提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與 LPS 組，bP<0.05；與 OMT+LPS組，cP<0.05。

2.2各組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡率比較 與對(duì)照組[(16.34±2.12)%]比較，LPS組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡率[(68.72±7.52)%]明顯升高，與LPS組比較，OMT+LPS組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡率[(51.42±3.65)%]有所降低，與OMT+LPS組比較，OMT+FYK-H+LPS組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡率[(31.36±3.06)%]進(jìn)一步降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3各組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞TLR4、AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9蛋白表達(dá)比較 LPS組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞TLR4表達(dá)明顯增加，AKT、GSK3β磷酸化蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。與LPS組比較，OMT明顯下調(diào)TLR4的表達(dá)，明顯上調(diào)P-AKTSer473/AKT、P-GSK3βSer9/GSK3β的表達(dá)，與OMT+LPS組比較，OMT+FYK中、高劑量明顯下調(diào)TLR4的表達(dá)，明顯上調(diào)P-GSK3βSer9/GSK3β的表達(dá)，OMT+FYK高劑量明顯上調(diào)P-AKTSer473/AKT的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與LPS組，bP<0.05；與OMT+LPS組，cP<0.05。

2.4各組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞Bax/Bcl-2、活性-caspase-3 mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，LPS組Bax/Bcl-2、活性-caspase-3 mRNA表達(dá)明顯增高，OMT能降低Bax/Bcl-2、活性-caspase-3 mRNA表達(dá)水平，聯(lián)合FYK預(yù)處理可進(jìn)一步下調(diào)Bax/Bcl-2、活性-caspase-3 mRNA的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與 LPS 組，bP<0.05；與 OMT+LPS組，cP<0.05。

3 討 論

急性肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞大量死亡，在此過(guò)程中肝細(xì)胞凋亡是最重要的分子機(jī)制[6-8]。本研究測(cè)定了OMT 聯(lián)合FYK 低、中、高劑量的藥物血清對(duì)大鼠肝BRL-3A細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，LPS能引起大鼠肝BRL-3A細(xì)胞活力明顯下降，OMT聯(lián)合FYK預(yù)處理能提高大鼠肝BRL-3A細(xì)胞活力。本研究流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS組大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡率明顯增加，OMT預(yù)處理后大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡率降低，OMT聯(lián)合FYK預(yù)處理后大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低。提示LPS可誘導(dǎo)刺激引起B(yǎng)RL-3A細(xì)胞凋亡，OMT聯(lián)合FYK能抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)瀑布式的基因表達(dá)結(jié)果，在其發(fā)生與調(diào)控過(guò)程中有許多基因產(chǎn)物的參與，PI3K/AKT 信號(hào)傳導(dǎo)途徑通過(guò)對(duì)凋亡相關(guān)基因的調(diào)節(jié)作用，在凋亡的發(fā)生與調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能[9-11]。磷酸化的AKT使GSK3β在絲氨酸Ser9位點(diǎn)上發(fā)生磷酸化，從而抑制GSK3β的活性，發(fā)揮抗凋亡作用[11]。TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路也參與了肝細(xì)胞凋亡過(guò)程，本研究采用LPS刺激大鼠肝BRL-3A細(xì)胞，建立了肝細(xì)胞凋亡模型，采用Western-blot法檢測(cè) 了經(jīng)LPS刺激后TLR4/PI3K/AKT/GSK3β通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，LPS刺激增加TLR4蛋白水平，降低了P-AKTSer473、P-GSK3βSer9水平，OMT可削弱LPS的作用，OMT聯(lián)合FYK預(yù)處理進(jìn)一步削弱了LPS誘導(dǎo)引起的TLR4水平增加，以及P-AKTSer473、P-GSK3βSer9水平下調(diào)。LPS處理顯著增加了肝細(xì)胞TLR4表達(dá)和PI3K/AKT/GSK3β激活，而OMT+FYK抑制了LPS誘導(dǎo)的侵襲和GSK3β、AKT的磷酸化。提示OMT聯(lián)合FYK可通過(guò)TLR4/PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路發(fā)揮抗凋亡作用，保護(hù)肝細(xì)胞。

Bcl-2 家族是PI3K/AKT信號(hào)通路的下游底物，其中Bcl-2(抗凋亡基因)和Bax(促凋亡基因)在體內(nèi)組成一個(gè)平衡體系，共同調(diào)控細(xì)胞凋亡，在急性肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。caspase-3是細(xì)胞凋亡執(zhí)行器，也是凋亡蛋白酶反應(yīng)的必經(jīng)之路[12-14]。LPS刺激后大鼠肝BRL-3A細(xì)胞Bax、活性-caspase-3表達(dá)明顯增加，Bcl-2表達(dá)降低，OMT可降低LPS的作用，OMT聯(lián)合FYK可使Bax、活性-caspase-3表達(dá)進(jìn)一步降低，Bcl-2表達(dá)進(jìn)一步增加，抗凋亡基因表達(dá)占優(yōu)勢(shì)，從而發(fā)揮肝細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述，LPS刺激后通過(guò)激活BRL-3A細(xì)胞TLR4，使TLR4表達(dá)增加，降低AKT、GSK3β 磷酸化水平，從而使Bax/Bcl-2比例和活性-caspase-3 mRNA表達(dá)增加，促凋亡因素占優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡。OMT通過(guò)抑制大鼠肝BRL-3A細(xì)胞TLR4的表達(dá)，使TLR4表達(dá)下降，上調(diào) AKT、GSK3β磷酸化水平，從而使Bax/Bcl-2比例和活性-caspase-3 mRNA表達(dá)減少，OMT聯(lián)合FYK可進(jìn)一步加強(qiáng)OMT的作用，從而顯著抑制大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡，表明OMT聯(lián)合FYK可通過(guò) TLR4/PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路抑制大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡。