趙 佳，黃琪峰，張 菁

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 杭州 310016)

原發(fā)性支氣管肺癌簡(jiǎn)稱(chēng)為肺癌，起源于支氣管黏膜上皮及肺泡，主要分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌。其中非小細(xì)胞肺癌包含肺腺癌、肺鱗癌及大細(xì)胞肺癌，約占肺癌的85%[1]。肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型，患者5年生存率低于15%[2]。近年來(lái)，除不斷完善肺癌患者的治療外，尋求有效指導(dǎo)臨床診斷的腫瘤標(biāo)志物也成為肺腺癌研究的熱點(diǎn)。嘌呤對(duì)能量代謝、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞繁殖至關(guān)重要；同時(shí)，也是輔酶、能量轉(zhuǎn)移分子、調(diào)節(jié)因子和參與RNA、DNA合成的前體蛋白[3]。磷酸核糖甘氨酰胺轉(zhuǎn)甲酰酶(GART)催化嘌呤從頭合成的第1次依賴(lài)葉酸的轉(zhuǎn)甲?；磻?yīng)[4]。癌細(xì)胞需要大量嘌呤來(lái)維持其加速生長(zhǎng)[5]。因此，GART作為癌癥化療的一個(gè)研究熱點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。然而，GART基因在肺腺癌患者預(yù)后中的作用尚鮮見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)手段分析了肺腺癌組織GART基因變化及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來(lái)源 2020年1月收集癌癥芯片數(shù)據(jù)庫(kù)Oncomine(https://www.Oncomine.org/resource/main.html)、癌癥基因組學(xué)分析門(mén)戶(hù)網(wǎng)站cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)、癌癥基因組學(xué)門(mén)戶(hù)網(wǎng)站UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)、生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)中肺腺癌組織GART基因變化及其與患者預(yù)后關(guān)系的相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2方法

1.2.1cBioPortal cBioPortal是一個(gè)交互式探索多維癌癥基因組學(xué)數(shù)據(jù)集的開(kāi)放網(wǎng)站[6]。登錄cBioPortal 網(wǎng)站首頁(yè)，數(shù)據(jù)集選擇“Lung adenocarcinoma(TCGA PanCancer Atlas)”，病例組選擇“Tumor Samples with mRNA data(RNA Seq V2，510)”，分別分析GART基因突變、拷貝數(shù)畸變、mRNA 水平變化及GART高表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。分析GART mRNA水平變化時(shí)選擇RNA測(cè)序結(jié)果，且選擇默認(rèn)閾值(表達(dá)量大于或等于2)。

1.2.2Oncomine Oncomine是目前世界上最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)和整合數(shù)據(jù)提取平臺(tái)[7]。登陸Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)首頁(yè)，輸入基因名稱(chēng)“GART”。分析其在Lung adenocarcinoma及肺正常組織的表達(dá)情況。

1.2.3UALCAN UALCAN是癌癥基因組學(xué)門(mén)戶(hù)網(wǎng)站[8]，登錄UALCAN 網(wǎng)站首頁(yè)，數(shù)據(jù)庫(kù)類(lèi)型選擇“Lung adenocarcinoma”，輸入基因名稱(chēng)“GART”，分析GART基因表達(dá)變化及其與患者預(yù)后(生存率)的關(guān)系。為考慮患者臨床特征對(duì)GART表達(dá)模式的影響，在UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中根據(jù)患者性別、年齡、種族、吸煙狀況及疾病分級(jí)情況對(duì)健康者和肺腺癌患者GART轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行亞組分析。

1.2.4DAVID DAVID是一個(gè)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具，為大規(guī)?；蚧虻鞍琢斜?成百上千個(gè)基因ID或蛋白ID列表)提供了系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，幫助用戶(hù)從中提取生物學(xué)信息[9]。登錄DAVID v6.8首頁(yè)，導(dǎo)入基因列表，獲得GO及KEGG-pathway富集通路。為確定GART在肺腺癌中的生物相互作用網(wǎng)絡(luò)，選取UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中與GART基因共表達(dá)基因的包括1個(gè)負(fù)相關(guān)基因和2 798個(gè)正相關(guān)基因。對(duì)這些基因進(jìn)行GO分析。

2 結(jié) 果

2.1Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果 GART在多種腫瘤中均有表達(dá)變化。本研究選取肺腺癌繼續(xù)進(jìn)行研究。與正常組織比較，其中7個(gè)數(shù)據(jù)集的肺腺癌患者GART 基因表達(dá)明顯上調(diào)。見(jiàn)圖1。

A.GART基因在不同類(lèi)型腫瘤中的表達(dá)情況，1.紅色代表異常高表達(dá)，藍(lán)色代表異常低表達(dá)；2.方格里的數(shù)字表示有多少個(gè)數(shù)據(jù)集的研究結(jié)果支持;B.GART基因在Landi數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況；C.GART基因在Selamat數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況；與正常組織比較，aP<0.05。

2.2cBioPortal 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果 501例肺腺癌患者中發(fā)生GART基因改變38例,包括錯(cuò)義突變、截短突變、基因融合、拷貝數(shù)畸變和mRNA水平上調(diào)；GART基因高表達(dá)不利于患者預(yù)后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GART在腫瘤組織中表達(dá)明顯高于正常組織。見(jiàn)圖2。

A.肺腺癌組織GART基因表達(dá)變化；B.肺腺癌組織GART表達(dá)變化與患者預(yù)后(生存率)的關(guān)系；C.GART基因在基于樣本類(lèi)型的肺腺癌中的表達(dá)情況。

2.3UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果 肺腺癌組織GART基因表達(dá)明顯升高，且在40歲以上、吸煙人群中GART的表達(dá)更為顯著。見(jiàn)圖3。

A.GART在健康者及肺腺癌患者各年齡段(>20～40、>40～60、>60～80、>80～100歲)的相對(duì)表達(dá)比較；B.GART在健康者及肺腺癌患者不同性別的相對(duì)表達(dá)比較；C.GART在健康者及肺腺癌患者吸煙狀況、戒煙各年齡段的相對(duì)表達(dá)比較；D.GART在任何種族個(gè)體及肺腺癌患者白人、非裔美國(guó)人、亞洲人的相對(duì)表達(dá)比較；E.GART在健康者及肺腺癌患者各階段(stage1、stage2、stage3、stage4)的相對(duì)表達(dá)比較；F.GART在健康者及肺腺癌患者各分期(N0、N1、N2、N3)的相對(duì)表達(dá)比較。與健康者比較，aP=0.001。

2.4DAVID富集分析結(jié)果 基因編碼主要定位于細(xì)胞核、核質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)；分子功能為蛋白質(zhì)結(jié)合、多聚RNA結(jié)合和ATP結(jié)合；主要參與細(xì)胞分裂、姐妹染色單體黏著和DNA復(fù)制等生物學(xué)過(guò)程；類(lèi)似地，京都基因和基因組百科全書(shū)(KEGG)途徑分析顯示，細(xì)胞周期、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA復(fù)制等途徑的富集。見(jiàn)圖4。

A.氣泡圖展示了在肺腺癌中與GART顯著相關(guān)的基因的富集結(jié)果細(xì)胞成分;B.生物過(guò)程;C.分子功能;D.KEGG通路。

3 討 論

肺腺癌是我國(guó)乃至全世界范圍內(nèi)發(fā)病率及致死率最高的惡性腫瘤。盡管近年來(lái)，肺腺癌的診治進(jìn)展迅速，但目前很多肺腺癌患者均在較晚期時(shí)才被診斷或發(fā)現(xiàn)，且一經(jīng)發(fā)現(xiàn)其預(yù)后極差，嚴(yán)重加重了患者的家庭負(fù)擔(dān)。研究判斷肺腺癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物，探討其臨床價(jià)值對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義[10]。

從頭嘌呤合成的幾個(gè)步驟中的突變導(dǎo)致人類(lèi)先天性代謝錯(cuò)誤，其通常以精神發(fā)育遲滯、張力減退、感覺(jué)神經(jīng)性聽(tīng)力喪失、視神經(jīng)萎縮和其他特點(diǎn)為特征[11]。GART基因編碼三功能蛋白，執(zhí)行3個(gè)步驟的從頭嘌呤合成。GART基因位于人21號(hào)染色體上，在患有唐氏綜合征的個(gè)體中具有異常調(diào)節(jié)和過(guò)表達(dá)，且可能參與了唐氏綜合征的表型[11]。已有證據(jù)表明，在結(jié)直腸癌患者氟尿嘧啶聯(lián)合亞葉酸鈣化療方案中，亞葉酸鈣的生化調(diào)節(jié)可使氟尿嘧啶增效，而亞葉酸鈣作用機(jī)制與葉酸代謝分子——GART等有關(guān)[12]。GART發(fā)揮活性需要10-甲?；臍淙~酸，近20年來(lái)一直是抗腫瘤藥物研發(fā)的靶標(biāo)[13-14]。已有研究表明，抗癌藥物對(duì)GART的抑制對(duì)于幾種培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系的侵襲性表型是有效的[15]。另外，有研究表明，GART高表達(dá)不利于肝癌患者的預(yù)后，且與肝癌細(xì)胞增殖有關(guān)[16]。然而，關(guān)于GART在人類(lèi)肺腺癌進(jìn)展中的作用及其機(jī)制知之甚少。

本研究使用基于生物信息學(xué)理論的在線(xiàn)工具對(duì)來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù)的腫瘤數(shù)據(jù)進(jìn)行目標(biāo)基因分析。與傳統(tǒng)芯片篩選比較，此方法具有樣本量大、成本低、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。使大規(guī)模肺腺癌基因組學(xué)研究和隨后的功能研究成為可能。首先，回顧一些來(lái)自O(shè)ncomine數(shù)據(jù)庫(kù)的腫瘤組織中GART的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，GART的表達(dá)在肺腺癌細(xì)胞中增加，提示其參與了肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。然后，cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示，GART的主要突變?yōu)閙RNA高表達(dá)，且高表達(dá)不利于患者預(yù)后，提示GART高表達(dá)可能可以作為判斷非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的新靶標(biāo)。隨后，對(duì)肺腺癌患者進(jìn)行臨床特征亞組分析發(fā)現(xiàn)，肺腺癌患者中40歲以上、吸煙人群GART的表達(dá)更為顯著。最后，進(jìn)一步對(duì)GART相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行確認(rèn)發(fā)現(xiàn)，GART改變的生物相互作用網(wǎng)絡(luò)主要涉及細(xì)胞周期和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。但由于本研究所使用的數(shù)據(jù)來(lái)源于公共數(shù)據(jù)庫(kù)，無(wú)法保證所有數(shù)據(jù)的質(zhì)量。其次本研究是完全基于數(shù)據(jù)分析開(kāi)展的，因此，尚需分子生物學(xué)方法在動(dòng)物或離體細(xì)胞上進(jìn)一步驗(yàn)證。