孫海楠， 嵇震宇， 汪有良 *

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)月季種質(zhì)資源圃，江蘇 南京 211153；3.句容市東進(jìn)林場(chǎng)，江蘇 句容 212400)

月季為薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)的多年生木本花卉，主要分為現(xiàn)代月季(R.hybrida)與古老月季(R.chinensis)2個(gè)類(lèi)群，可實(shí)現(xiàn)周年開(kāi)花[1]。因其寓意美好且具有豐富的色彩和花朵類(lèi)型，深受人們喜愛(ài)，在園林綠化與家庭園藝中有著廣泛的應(yīng)用[2]。隨著人民生活水平的不斷提高，人們對(duì)月季的觀(guān)賞需求也不斷提高，不僅需要豐富的花型花色，還需要芳香的花朵香氣?；ǘ涞南銡?不僅可以使人身心愉悅，其中的部分活性成分，還對(duì)人的身心健康有積極作用。如今,花朵香氣已成為影響月季觀(guān)賞價(jià)值的一個(gè)重要因素[3-4]。本研究采用頂空-固相微萃取法(HS-SPME，headspace solid phase microextraction)對(duì)5個(gè)具備芳香氣味的月季品種的花朵香氣進(jìn)行富集提取，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS，gas chromatography-mass spectrometry)法對(duì)其香氣成分進(jìn)行鑒定與分析，為后期芳香月季品種的引進(jìn)與選育提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 植物材料

供試的月季材料現(xiàn)代月季品種‘香粉蝶’‘杰·喬伊’‘粉和平’與古老月季品種‘紫紅香’‘月月粉’，均取自江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院月季種質(zhì)資源圃?xún)?nèi)3年生以上的植株。在上述品種的盛花期取新鮮的花瓣，每個(gè)品種的花瓣來(lái)自于3個(gè)以上的單株，將花瓣用去離子水洗凈并吸干表面水分后,陰干備用，取樣時(shí)間為晴天的10：00—14：00。

1.2 試驗(yàn)儀器

因花朵的香氣組分多為小分子的非極性化合物，故選擇100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS，Polydimethylsiloxane)涂層的SPME萃取頭(美國(guó)Supelco公司)；GC-MS選用7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)，色譜柱選用HP-5毛細(xì)管柱(30 m× 0.25 mm × 0.25 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司);頂空進(jìn)樣瓶為40 mL棕色頂空瓶(美國(guó)安捷倫科技有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

SPME萃取頭如果是首次使用或長(zhǎng)時(shí)間未使用，應(yīng)在萃取試驗(yàn)前進(jìn)行活化，活化過(guò)程為250 ℃保持30 min，并需惰性氣體保護(hù)。準(zhǔn)確稱(chēng)取上述各品種的花瓣2.0 g，放置于頂空進(jìn)樣瓶中，并用聚四氟乙烯材質(zhì)的密封墊密封。隨后將頂空瓶置于60 ℃水浴中，并將活化好的萃取頭插入頂空瓶中，富集提取15 min，萃取完成后,立即將萃取頭置于氣相色譜的進(jìn)樣口中進(jìn)行解析。解析條件為250 ℃下3 min。每個(gè)月季品種試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 氣相色譜與質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置

色譜柱升溫程序：首先在50 ℃下保持2 min，之后進(jìn)行升溫，50—180 ℃之間的升溫速度為5 ℃/min，180—270 ℃之間的升溫速度為20 ℃/min，最后在270 ℃下保持5 min。氣相色譜載氣為高純氦(純度99.999%)，載氣流速為1 mL/min。質(zhì)譜儀的離子源溫度設(shè)定為230 ℃，電離方式為電子電離(EI，Electron Ionization)，電離能為70 eV，掃描范圍為40—500原子質(zhì)量單位(amu，atomic mass unit)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

花朵香氣混合物中的各成分經(jīng)過(guò)氣相色譜分離后形成了不同的色譜峰，利用安捷倫色譜工作站對(duì)各色譜峰進(jìn)行積分計(jì)算以獲得各成分的峰面積。各成分的相對(duì)含量采用歸一化法計(jì)算，對(duì)應(yīng)的色譜峰經(jīng)質(zhì)譜儀掃描后的質(zhì)譜圖通過(guò)檢索NIST/Wily數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物質(zhì)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同月季品種香氣成分?jǐn)?shù)量

本試驗(yàn)將3次樣本重復(fù)中均出現(xiàn)且質(zhì)譜圖檢索比對(duì)匹配度均高于90%的成分視為可鑒定物質(zhì)。結(jié)果如表1所示，‘香粉蝶’鑒定出了最多的香氣成分，其數(shù)量達(dá)30種，可鑒定物質(zhì)占總峰面積的98.57%；其次為‘月月粉’，鑒定出的香氣成分為27種，占總組分98.09%；‘紫紅香’‘粉和平’鑒定出25種香氣成分，鑒定出成分總量占總組分含量為97.54%；‘杰·喬伊’與‘粉和平’均鑒定出21種成分，為本次試驗(yàn)的5個(gè)品種中鑒定出成分最少的品種，其總含量分別為97.90%與98.15%。本試驗(yàn)中,5個(gè)月季品種獲得的可鑒定香氣成分?jǐn)?shù)量雖略有差異，但可鑒定成分總量在總組分中所占比例，均較為接近，其區(qū)間范圍為97.54%—98.57%。

2.2 不同月季品種香氣成分的組成

通過(guò)對(duì)5個(gè)月季品種香氣成分的分析，共鑒定出45種化合物。由表1可見(jiàn)，月季花朵香氣中的成分涵蓋了烷烴、烯烴、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、酚類(lèi)、酯類(lèi)、酸類(lèi)、醚類(lèi)9個(gè)物質(zhì)類(lèi)型。其中烯烴類(lèi)最多,為12種，主要由單萜與倍半萜組成；其次為醇類(lèi)，數(shù)量為10種；酯類(lèi)與醛類(lèi)分別為9種與6種，而酮類(lèi)、酚類(lèi)、酸類(lèi)均為2種，醚類(lèi)與烷烴均只有1種。

表1 各月季品種花朵香氣相對(duì)含量

由表2可知，‘杰·喬伊’香氣中主要的成分類(lèi)型為酯類(lèi)物質(zhì)，其占比為62.70%，烯烴類(lèi)物質(zhì)與醇類(lèi)物質(zhì)分別占比14.28%與14.09%，3種物質(zhì)所占總額超過(guò)該品種花朵香氣總組分的90%；‘紫紅香’香氣中主要為酯類(lèi)與醇類(lèi)，占比分別為54.13%與27.01%?！惴鄣泻枯^高的為醛類(lèi)與醇類(lèi)，其含量分別為32.14%與26.97%，烯烴類(lèi)物質(zhì)占比為18.98%，亦屬于含量較高的物質(zhì)類(lèi)型；‘粉和平’中含量較高的為醇類(lèi)、酯類(lèi)與酚類(lèi)，其含量分別為46.97%，32.08%，14.59%，3類(lèi)物質(zhì)占比也超過(guò)了90%；‘月月粉’中占比較高的物質(zhì)類(lèi)型為醇類(lèi)、醛類(lèi)與酮類(lèi)，含量分別為35.98%，24.42%，14.62%。

從表2可以看出，醇類(lèi)物質(zhì)在所有的試驗(yàn)品種香氣總組分中均具有較高占比。酯類(lèi)物質(zhì)在‘杰·喬伊’與‘紫紅香’中占比均超過(guò)一半。酚類(lèi)物質(zhì)除了在‘粉和平’中占比為14.59%，在其余4個(gè)品種中含量均不超過(guò)10%。酮類(lèi)物質(zhì)除了在‘月月粉’中占比為14.62%，在另4個(gè)品種中含量均不超過(guò)5%。烯烴類(lèi)與醇類(lèi)物質(zhì)在各試驗(yàn)品種中的含量各有差異。烷烴類(lèi)物質(zhì)在‘香粉蝶’與‘粉和平’中均未檢測(cè)到，其余3個(gè)試驗(yàn)品種中含量均不超過(guò)5%。酸類(lèi)與醚類(lèi)物質(zhì)在所有試驗(yàn)品種中占比均較小。酸類(lèi)物質(zhì)在‘紫紅香’‘香粉蝶’‘粉和平’中占比均低于1%，其余試驗(yàn)品種中則未檢測(cè)到；醚類(lèi)物質(zhì)除了在‘月月粉’香氣組分中占比為1.85%外，其余試驗(yàn)品種中的物質(zhì)占比均小于1%，且在‘紫紅香’中未檢測(cè)到。

表2 各月季品種花朵香氣成分類(lèi)型

從分子結(jié)構(gòu)類(lèi)型看，所有的烯烴類(lèi)物質(zhì)均為具有異戊二烯結(jié)構(gòu)的萜烯(單萜與倍半萜)，且眾多的含氧有機(jī)物多為萜烯衍生物與苯環(huán)類(lèi)化合物，還有部分脂肪酸及衍生物與其他化合物。由表3可以看出，在所有鑒定出的45種成分中，單萜與倍半萜分別為5種與7種，其各自的含氧衍生物分別為9種與2種，萜類(lèi)物質(zhì)共23種。此外，苯環(huán)類(lèi)化合物為12種，脂肪酸及其衍生物5種，其他結(jié)構(gòu)的化合物為5種?！堋桃痢霞t香’‘粉和平’的主要香氣成分均為脂肪酸類(lèi)與萜類(lèi)物質(zhì)，其總含量分別為91.73%，82.46%，76.43?！惴鄣c‘月月粉’的主要香氣成分為萜類(lèi)與苯環(huán)類(lèi)化合物，其總含量分別為89.69%與79.60%，但‘粉和平’的花朵香氣中苯環(huán)類(lèi)化合物的占比也達(dá)到了21.60%。

表3 各月季品種花朵香氣成分分子結(jié)構(gòu)類(lèi)型

2.3 不同月季品種的主要香氣成分

本試驗(yàn)將含量超過(guò)5%的物質(zhì)視為該試驗(yàn)品種的主要香氣成分。如表4所示，共有14種物質(zhì)在本次試驗(yàn)中的相對(duì)含量高于5%。主要成分的總含量除了在‘香粉蝶’中占78.25%外，在其他試驗(yàn)品種香氣成分中的占比均在85%以上。

表4 各月季品種花朵香氣主要成分

乙酸葉醇酯在所有的試驗(yàn)品種中均為主要成分，但含量差異較大，在‘杰·喬伊’與‘紫紅香’中含量較高，分別達(dá)到57.97%與44.51%，在‘香粉蝶’與‘月月粉’中含量較少，僅為6.52%與5.61%。香葉醇、丁香酚、大根香葉烯-D與橙花叔醇4種物質(zhì)在2個(gè)試驗(yàn)品種中均為主要成分，其中香葉醇在‘粉和平’與‘月月粉’中、丁香酚在‘香粉蝶’與‘月月粉’中、大根香葉烯-D在‘杰·喬伊’與‘香粉蝶’中、橙花叔醇在‘紫紅香’與‘月月粉’中共為主要成分。3-己烯-1-醇、苯乙醇、樟腦、3,5-二甲氧基甲苯、橙花醇、香茅醇、1,3,5-三甲氧基苯、甲基丁香酚、乙酸香葉酯這9種物質(zhì)僅為1個(gè)試驗(yàn)品種的主要香氣成分。橙花醇僅在‘杰·喬伊’的花朵香氣中為主要成分，其含量為5.68%，與‘粉和平’中的4.35%差別不明顯，香粉蝶中該物質(zhì)的含量為1.03%，剩余試驗(yàn)品種中則未檢出。乙酸香葉酯為‘紫紅香’花朵香氣中特有的主要成分，其含量為7.67%，其他試驗(yàn)品種中該物質(zhì)的含量均在1%以下。苯乙醇與3,5-二甲氧基甲苯為‘香粉蝶’中的主要成分，含量分別為9.04%與31.87%。香茅醇與甲基丁香酚為‘粉和平’中的主要香氣成分，其含量分別為9.15%與14.59%。在剩余的試驗(yàn)品種中甲基丁香酚除了在‘香粉蝶’中的含量為1.87%外，其余品種的含量均在1%以下或未檢出；香茅醇除了在‘杰·喬伊’中含量為1.52%外，其余品種的含量也均在1%以下。3-己烯-1-醇、樟腦與1,3,5-三甲氧基苯僅在‘月月粉’花朵香氣中為主要成分，其含量分別為8.33%，21.45%，14.62%。樟腦為‘月月粉’中特有的主要成分，在其他試驗(yàn)品種中該物質(zhì)的相對(duì)含量均在1%以下。

3 討論與小結(jié)

目前，已有對(duì)桂花、野茉莉等樹(shù)種花香組分進(jìn)行的研究報(bào)道[5-6]。花朵的香氣成分是植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，多為分子質(zhì)量在100—200之間的小分子化合物，具有沸點(diǎn)低、易揮發(fā)的特點(diǎn)[4]。本研究中所鑒定出45種香氣成分的分子量在60—268之間，中位數(shù)為152，符合植物次生代謝的特征?；ǘ湎銡庖蚱涑煞謴?fù)雜且易揮發(fā)的原因，收集較為困難，因此選擇高效的提取與收集方法十分重要。SPME作為一種新型的樣品前處理技術(shù)，將樣品的收集、濃縮、解析集成在一起，且具有體積小、操作簡(jiǎn)便、提取效率與重復(fù)性高等特點(diǎn)，且可根據(jù)不同樣品類(lèi)型選擇不同涂層的萃取頭[7]。本試驗(yàn)中，對(duì)5個(gè)月季品種香氣成分的有效提取率在97.54%—98.57%之間，可見(jiàn)SPME法對(duì)月季花朵香氣成分具有較高的提取效率。

根據(jù)其生物合成途徑，植物花朵香氣物質(zhì)可以分為萜類(lèi)、苯丙烷類(lèi)以及部分脂肪酸衍生物，與本研究中月季花朵香氣成分的主要分子結(jié)構(gòu)類(lèi)型相吻合。其中萜類(lèi)物質(zhì)起源于甲羥戊酸途徑，其分子具備典型的異戊二烯結(jié)構(gòu)[8]。本試驗(yàn)中共鑒定出萜類(lèi)物質(zhì)23種，全部為單萜、倍半萜及其對(duì)應(yīng)的含氧衍生物，未發(fā)現(xiàn)二萜及更大的萜類(lèi)分子，萜類(lèi)物質(zhì)的數(shù)量占據(jù)所有可鑒定成分?jǐn)?shù)量的一半以上，是月季花朵香氣成分中數(shù)量最多的分子結(jié)構(gòu)類(lèi)型。在遠(yuǎn)緣雜交月季品種‘天香’香氣成分的主成分分析中，萜烯及其含氧衍生物的方差貢獻(xiàn)值高達(dá)72.625%，為花朵香氣中最重要的組成部分[9]。該研究與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致。苯丙烷類(lèi)物質(zhì)為花朵香氣成分中另一類(lèi)主要成分，目前多認(rèn)為該類(lèi)物質(zhì)起源于莽草酸途徑。莽草酸的環(huán)狀分子在脫氫酶的作用下，生成苯環(huán)類(lèi)物質(zhì)，進(jìn)入下一步代謝過(guò)程[10]。本試驗(yàn)中共鑒定出苯環(huán)類(lèi)化合物12種，該類(lèi)物質(zhì)在‘香粉蝶’中的占比超過(guò)50%，在‘粉和平’與‘月月粉’中的占比也達(dá)21.60%與26.17%，認(rèn)為苯環(huán)類(lèi)化合物同樣為月季花朵香氣重要的組成部分。脂肪酸及其衍生物的合成主要由合成酶、合成限速酶與碳鏈延長(zhǎng)中止酶共同作用[11]。本試驗(yàn)中脂肪酸及衍生物在‘杰·喬伊’‘紫紅香’‘粉和平’中都有較高的占比，分別達(dá)到了58.79%，44.80%與31.52%。

乙酸葉醇酯的含量幾乎占據(jù)了所有的脂肪酸及衍生物的含量，且為本次試驗(yàn)唯一在所有試驗(yàn)品種中都為主要成分的物質(zhì)。乙酸葉醇酯具有明顯的青草、青葉和青果的氣味，廣泛存在于綠茶中[12]，這與‘杰·喬伊’‘紫紅香’氣味均較為淡雅相吻合。橙花叔醇呈現(xiàn)出類(lèi)似玫瑰及蘋(píng)果的氣味，具較淡的甜香，為大馬士革玫瑰中的主要呈香物質(zhì)之一[13]，‘紫紅香’的花朵香氣中，橙花叔醇含量?jī)H次于乙酸葉醇酯，導(dǎo)致該品種的氣味中略帶清甜的果香。

‘香粉蝶’的花朵香氣與傳統(tǒng)香水月季十分相似?！惴鄣ǘ涞南銡獬煞种泻孔罡叩奈镔|(zhì)為3,5-二甲氧基甲苯。該物質(zhì)存在于眾多的香水月季中，是構(gòu)成香水月季清新香味的重要組成部分[14]?！惴鄣械牧硪恢饕煞直揭掖迹瑸橹T多薔薇野生種花朵香氣中的主要成分，在百葉薔薇與大馬士革玫瑰的花朵香氣中均有高達(dá)69%的分布[15]?！惴鄣蔷哂邢闼录镜湫拖銡獾拇蠡ㄌ俦驹录?，具有生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、高抗白粉病、中抗黑斑病的特點(diǎn)，該品種重要的原始親本正是云南香水月季與薔薇野生種[16]?！酆推健ǘ湎銡庵械闹饕煞譃橐宜崛~醇酯、香葉醇與甲基丁香酚。袁敏芝等對(duì)‘粉和平’花朵香氣成分的測(cè)定中，乙酸葉醇酯的相對(duì)含量為24.59%，與本研究28.66%的研究結(jié)果類(lèi)似[17]。葉靈軍等在對(duì)現(xiàn)代月季的香氣成分分析中，‘粉和平’乙酸葉醇酯的相對(duì)含量為35.2%，此外乙酸橙花酯與乙酸己酯的含量分別為44.3%，12.6%，而本研究中‘粉和平’對(duì)應(yīng)的2種物質(zhì)的含量?jī)H為0.81%，2.61%[18]。這可能是不同的栽植環(huán)境、開(kāi)放階段、取樣時(shí)間等因素，對(duì)花朵的香氣成分產(chǎn)生差異[15]。‘月月粉’的花朵香氣中有7種物質(zhì)的含量均超過(guò)了5%，是各試驗(yàn)品種中主要成分相對(duì)含量分布較為均勻的品種?！略路邸ǘ湎銡庵泻孔罡叩某煞譃檎聊X，其次為1,3,5-三甲氧基苯。這2種物質(zhì)在其他試驗(yàn)品種中均為非主要成分或未檢出。晏慧君等對(duì)‘月月粉’香氣成分的鑒定結(jié)果表明，樟腦和1,3,5-三甲氧基苯的含量分別為24.10%，9.81%，與本研究結(jié)果接近[15]。

本研究通過(guò)SPME法對(duì)5個(gè)具備芳香氣味的月季品種進(jìn)行了花朵香氣的收集，確定了SPME在月季花朵香氣收集方面具有較高的提取效率?；ǘ湎銡獬煞值腉C-MS分析表明，月季花朵香氣成分中的主要物質(zhì)為萜類(lèi)物質(zhì)、苯環(huán)類(lèi)化合物、脂肪酸及其衍生物，而萜類(lèi)物質(zhì)為月季花朵香氣成分中數(shù)量最多的成分。月季花朵香氣中重要的成分有乙酸葉醇酯、3,5-二甲氧基甲苯、1,3,5-三甲氧基苯、樟腦、香葉醇等。希望這些結(jié)果能為今后月季芳香品種的選育，及月季花朵香氣成分及合成機(jī)制的研究，提供理論指導(dǎo)。