江林春，韋潔敏，白尚尚，強(qiáng) 毅，崔浪軍，劉世鵬*

(1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安716000；2.西北瀕危藥材資源開發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119)

華中五味子(SchisandrasphenantheraRehd.Et Wils.)為木蘭科(Magnoliaceae)五味子屬(Schisandra)多年生落葉木質(zhì)藤本植物，以干燥成熟果實(shí)入藥。中藥名為南五味子，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材[1]，被收錄于《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)[2]，有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心之功效[3]，食用和藥用價(jià)值高。在我國(guó)主要分布于秦巴山區(qū)，且以野生撫育資源為主[4]。華中五味子為須根系藤本植物，須根發(fā)達(dá)[5]，常與伴生樹種組成群落，具有較強(qiáng)的截流雨水、減緩雨水沖刷坡面和固土的能力，已成為秦巴山區(qū)水土保持和藥農(nóng)脫貧致富的主要藥材品種。近年來華中五味子在秦巴山區(qū)規(guī)?；斯しN植和野生撫育的面積逐年增加，如何進(jìn)行科學(xué)田間管理和野生撫育管理是目前亟待解決的問題。了解華中五味子自然狀況下根際土壤化學(xué)性質(zhì)、真菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)的變化對(duì)于華中五味子田間管理與野生撫育方案的確定具有重要的指導(dǎo)意義，但目前尚未見這方面的報(bào)道?；诖?，本文系統(tǒng)研究了華中五味子2年生苗種植3年和6年后根際土壤化學(xué)性質(zhì)和土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，分析了二者的相互關(guān)系，以期為華中五味子的科學(xué)田間管理與野生撫育方案的確定提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2013年3月在陜西省商洛市柞水縣下梁鎮(zhèn)布置試驗(yàn)田。試驗(yàn)田翻土后起隆，按株行距1 m×1.5 m栽種兩年生健康華中五味子苗。正常田間管理，包括拔草、灌溉、搭架等，但不施肥，拔草和修剪后將雜草和修剪枝條移出試驗(yàn)田，但秋季落葉保留在試驗(yàn)田不清理。

1.2 試驗(yàn)材料

2013年3月、2016年3月和2019年3月采用5點(diǎn)取樣法采集根際土壤樣本，標(biāo)記為CK、Y3和Y6。收集的土壤樣品過2 mm孔徑篩子后一部分風(fēng)干用于測(cè)定土壤化學(xué)性質(zhì)；另一部分低溫保存，用于后續(xù)土壤微生物真菌多樣性的確定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定

大量與微量元素含量的測(cè)定用PW2403型X-Ray熒光光譜儀(德國(guó)Bruker公司)。銨態(tài)氮、磷酸鹽的含量測(cè)定用SmartChem300全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀(意大利Westco公司)。

1.3.2 土壤樣品高通量測(cè)序

利用試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取土壤樣本基因組DNA后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)得到引物，采用真菌ITS1區(qū)通用引物[6]，在引物末端加上測(cè)序接頭，以樣本DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)，并利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA提取質(zhì)量[7]。選擇質(zhì)量合格的DNA樣品進(jìn)行真菌ITS1區(qū)Paired-end測(cè)序，由北京百邁客科技有限公司完成，使用Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，數(shù)據(jù)分析參考文獻(xiàn)方法[8]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤的計(jì)算，采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年限華中五味子根際土壤化學(xué)性質(zhì)含量變化

研究表明，3個(gè)樣本中銨態(tài)氮(NH3-N)、速效磷(A-P)、S含量顯著上升(P<0.05)，其中銨態(tài)氮、S的含量均為Y3>Y6>CK，速效磷的含量為Y6>Y3>CK。Y3中銨態(tài)氮、S的含量分別比CK增加108.18%、139.06%。而隨華中五味子種植年限延長(zhǎng)，土壤中微量元素Fe3+、Mn2+、Zn2+、Pb的含量均低于CK，但無顯著差異(P>0.05)，總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(表1)。

表1 不同年限華中五味子根際土壤化學(xué)性質(zhì)含量

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)的合理性分析

通過Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)土壤樣品進(jìn)行真菌多樣性檢測(cè)分析，獲得真菌有效序列46 782條，序列的長(zhǎng)度主要分布在191 bp-280 bp的區(qū)段內(nèi)，其中221 bp-250 bp區(qū)段內(nèi)分布最多。由于序列長(zhǎng)度是將序列匹配到數(shù)據(jù)庫(kù)從而產(chǎn)生基因注釋的關(guān)鍵，因此根據(jù)這些優(yōu)質(zhì)序列分析得到的物種多樣性結(jié)果科學(xué)、真實(shí)，具有一定的參考價(jià)值[9]。圖1顯示隨著隨機(jī)抽取的樣本真菌測(cè)序量不斷增大，各樣品OTU數(shù)目的增加趨于平緩，說明每個(gè)樣品測(cè)序數(shù)量已經(jīng)滿足數(shù)據(jù)分析需求，因此測(cè)序數(shù)據(jù)充足、合理，可以用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

2.3 根際土壤真菌的數(shù)量分析

選取屬水平的OTU列表，在相似度為97%的水平下對(duì)OTU的聚類結(jié)果進(jìn)行分析。由圖2可知，在屬水平上，隨著種植年限的增加，土壤真菌的OTU數(shù)目呈現(xiàn)一個(gè)增加的趨勢(shì)。3個(gè)樣本中真菌的物種總數(shù)為962種，共有物種數(shù)量為389種，CK特有的物種數(shù)為55種，Y3特有的物種數(shù)為135種，Y6特有的物種數(shù)為70種。

2.4 華中五味子根際土壤真菌生物多樣性

通過微生物多樣性指數(shù)比較不同年限華中五味子根際土壤真菌的α多樣性(表2)，CK、Y3與Y6的根際土壤真菌的Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)大小均呈現(xiàn)為Y3>Y6>CK，表明Y3的土壤真菌豐度最高，Y6次之，CK最低。CK、Y3與Y6的Shannon指數(shù)分別為4.48、4.16和4.41，呈現(xiàn)為：CK>Y6>Y3，表明CK的土壤真菌群落多樣性最高，Y6次之，Y3多樣性最低。

表2 不同年限華中五味子根際土壤真菌α多樣性指數(shù)

2.5 華中五味子根際土壤真菌群落組成的比較分析

使用QIIME軟件進(jìn)行β多樣性(Beta diversity)分析，比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度。根際土壤樣本中真菌群落的主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的樣品差異性貢獻(xiàn)率分別達(dá)到61.29%和26.07%(見圖3)。CK、Y3與Y6均分布在PC1和PC2的區(qū)域內(nèi)，并且每個(gè)種植年限根際土壤樣品中的真菌群落相對(duì)集中。圖3表明CK和Y62組根際土壤樣品內(nèi)真菌群落組成相似，與Y3的土壤樣品真菌群落組成有差異。

2.6 華中五味子根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

由各個(gè)樣品在科水平和屬水平上的真菌群落物種豐度熱圖(圖4)可知，在供試的3個(gè)土樣中共注釋出18個(gè)相對(duì)豐度較大真菌科類(圖4a)：其中CK中毛殼菌科Chaetomiaceae(12.54%)、赤殼科Nectriaceae(19.27%)、被孢霉科Mortierellaceae(7.93%)、毛球殼科Lasiosphaeriaceae(3.03%)、枝孢霉科Cladosporiaceae(4.62%)的相對(duì)豐度較大。Y3中Plectosphaerellaceae(11.20%)、亞隔孢殼科Didymellaceae(14.39%)、Mrakiaceae(12.03%)、柔膜菌科Helotiaceae(5.77%)的相對(duì)豐度較大。Y6中毛殼菌科Chaetomiaceae(12.22%)、Piskurozymaceae(6.63%)、球腔菌科Mycosphaerellaceae(3.32%)、赤殼科Nectriaceae(19.63%)和Piskurozymaceae(6.63%)的相對(duì)豐度較大。由圖4(b)可知，CK的優(yōu)勢(shì)真菌屬為枝鼻菌屬Cladorrhinum(2.56%)、分子孢子菌屬Cladosporium(4.62%)、腐質(zhì)霉屬Humicola(4.13%)、被孢霉屬M(fèi)ortierella(7.86%)和尖孢鐮刀菌屬Fusarium(6.98%)；亞隔孢殼屬Didymella(10.57%)、赤霉菌屬Gibberella(2.40%)、Tausonia(10.69%)和Tetracladium(5.56%)為Y3的優(yōu)勢(shì)真菌屬；青霉菌屬Penicillium(1.52%)、緊密帚枝霉屬Sarocladium(4.85%)、Solicoccozyma(6.63%)為Y6的優(yōu)勢(shì)真菌屬。

真菌群落熱圖中CK、Y3和Y6真菌群落結(jié)構(gòu)差異性較大。CK的優(yōu)勢(shì)真菌屬隨著華中五味子種植年限的增加呈現(xiàn)總體降低的趨勢(shì)：分子孢子菌屬Cladosporium在CK、Y3及Y6中所占比例分別為4.62%、4.42%、0.71%，腐質(zhì)霉屬Humicola在CK、Y3及Y6中所占比例分別為4.13%、3.85%、2.89%。被孢霉屬M(fèi)ortierella在CK、Y3及Y6中所占比例分別為7.86%、1.23%、2.31%，尖孢鐮刀菌屬Fusarium在CK、Y3及Y6中所占比例分別為6.98%、1.07%、3.35%。

2.7 真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤化學(xué)性質(zhì)相關(guān)性分析

從冗余分析(RDA)圖(圖5)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CK、Y3及Y6 3個(gè)樣本中各類真菌與土壤化學(xué)因子分布在3個(gè)象限內(nèi)。對(duì)土壤中的優(yōu)勢(shì)真菌菌群(屬水平)和土壤化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)分析，其中銨態(tài)氮對(duì)根際土壤樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬如被孢霉屬M(fèi)ortierella、尖孢鐮刀菌屬Fusarium、分子孢子菌屬Cladosporium、腐質(zhì)霉屬Humicola的相關(guān)性影響最大，Mn2+對(duì)根際土壤樣品中優(yōu)勢(shì)真菌的相關(guān)性影響最小。被孢霉屬M(fèi)ortierella、尖孢鐮刀菌屬Fusarium與Mn2+、Zn2+呈正相關(guān)，與速效磷、銨態(tài)氮、S呈負(fù)相關(guān)；分子孢子菌屬Cladosporium、腐質(zhì)霉屬Humicola與Mn2+、Zn2+呈正相關(guān)，與速效磷、銨態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

本研究表明，隨華中五味子種植時(shí)間延長(zhǎng)，根際土壤的化學(xué)性質(zhì)的含量發(fā)生了變化。方差分析結(jié)果顯示，種植華中五味子3年、6年后，土壤中銨態(tài)氮、速效磷、S的含量顯著增加(P<0.05)，這與在懷牛膝[10]、牡丹[11]和藤本植物[12]上的研究結(jié)果一致。其原因可能是華中五味子生長(zhǎng)期內(nèi)對(duì)N、P和S的需求量由高變低，同時(shí)，果實(shí)成熟末期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累運(yùn)輸至根，根部?jī)?chǔ)存養(yǎng)分并隨著根系分泌物及地上的枯落物將養(yǎng)分輸送到土壤。李愛民[13]和叢毓[14]對(duì)北五味子的研究結(jié)果亦得出了這樣的結(jié)論。卜海東[5]對(duì)華中五味子地上部分生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)態(tài)研究，結(jié)果顯示，在整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)華中五味子對(duì)微量元素Fe3+、Mn2+、Zn2+均有較大的需求量，需要從土壤中大量吸收這些元素來滿足生長(zhǎng)所需。本研究的結(jié)果中華中五味子種植年限增加，土壤微量元素Fe3+、Mn2+、Zn2+、Pb的含量下降也側(cè)面驗(yàn)證了這一結(jié)果?？梢?，根際土壤理化性質(zhì)能夠體現(xiàn)土壤的健康狀況[15]，同時(shí)也反映出華中五味子植株生長(zhǎng)與發(fā)育所需要的營(yíng)養(yǎng)元素狀況。

α多樣性指數(shù)顯示，華中五味子隨種植年限延長(zhǎng)，根際土壤真菌群落豐富度增加，物種多樣性降低。這與根系的作用有關(guān)。研究表明，根系分泌物可增強(qiáng)根際土壤真菌的活性[16]，改變其多樣性和群落結(jié)構(gòu)。土壤理化特性的改變可間接影響土壤微生物的分布與活性。對(duì)嶗山茶區(qū)茶樹根圍AM真菌多樣性的研究證明，隨著栽培時(shí)間增長(zhǎng)，AM真菌優(yōu)勢(shì)菌種不斷積累，非優(yōu)勢(shì)菌種逐漸消失，物種多樣性降低[17]，這與本研究具有相似之處。其可能原因?yàn)槿A中五味子作為多年生植物，隨著栽培時(shí)間增加，根系形態(tài)和根系分泌物的變化，導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)真菌數(shù)量增加，非優(yōu)勢(shì)真菌種逐漸減少直至消失，使真菌在根際間的種類和分布產(chǎn)生了顯著差異，進(jìn)而影響真菌的種群結(jié)構(gòu)和代謝功能多樣性，導(dǎo)致土壤真菌群落多樣性降低。華中五味子植物須根發(fā)達(dá)，枯落物豐富，隨著種植年限延長(zhǎng)，在通過根系分泌物以及枯落物對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響較大，使土壤養(yǎng)分提高，進(jìn)而使得土壤真菌群落分布不均，通過長(zhǎng)期生長(zhǎng)的過程中一定程度上改變了根際土壤環(huán)境，變動(dòng)了土壤穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，增大土壤微生物豐度和均勻度，從而有利于土壤微生物的代謝，使得土壤真菌群落豐富度增大。

β多樣性結(jié)果表明，CK與Y6華中五味子的根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)在科水平和屬水平相似。赤殼科Nectriaceae屬肉座菌目，已有研究發(fā)現(xiàn)歸屬于子囊菌門的肉座菌目具有降解腐爛有機(jī)質(zhì)，降解纖維素的作用[8]。尖孢鐮刀菌屬Fusarium是引起枯萎病的主要病原菌屬[18-20]。分子孢子菌屬Cladosporium真菌是一種包括室內(nèi)和室外都常見的霉菌，為腐生真菌，廣泛存在于自然界的土壤、某些動(dòng)物的糞便、蔬菜、腐木、鳥巢、腐爛水果中，會(huì)導(dǎo)致果實(shí)腐爛[21]。腐質(zhì)霉屬Humicola真菌是土壤中常見的腐生菌，廣泛分布于世界各地的各種土壤，尤其是有機(jī)質(zhì)豐富的土壤，部分種類也分布于植物殘?bào)w、木材或人體等[22]。被孢霉屬M(fèi)ortierella是土壤中有益微生物，具有溶解土壤中磷的功能[23]，并且能夠通過提供氮營(yíng)養(yǎng)和提高植物的抗病性來促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，可能與植物的糖代謝有關(guān)[24]。從屬水平分析結(jié)果來看，不同年限華中五味子根際土壤的優(yōu)勢(shì)真菌屬存在差異性，說明隨著華中五味子種植年限增加，優(yōu)勢(shì)真菌屬一直在變動(dòng)，其中尖孢鐮刀菌屬Fusarium、分子孢子菌屬Cladosporium、腐質(zhì)霉屬Humicola等病原菌的生長(zhǎng)可能會(huì)受到抑制，一定程度上改善了華中五味子根際土壤環(huán)境，提高了土壤的健康狀況，促進(jìn)華中五味子植株的生長(zhǎng)發(fā)育。

土壤化學(xué)因子與土壤微生物群落顯著相關(guān)，土壤環(huán)境因子的改變會(huì)影響土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)[25，26]。有研究發(fā)現(xiàn)，土壤化學(xué)性質(zhì)不僅能夠反映土壤的健康狀況，還能夠影響土壤微生物種群數(shù)量及分布，為土壤根際微生物活動(dòng)提供營(yíng)養(yǎng)和能源[27]。本研究對(duì)土壤真菌群落與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)分析表明，隨著華中五味子種植時(shí)間延長(zhǎng)，土壤化學(xué)性質(zhì)與各真菌群落間具有一定的相關(guān)性，其中：速效磷、銨態(tài)氮、S與尖孢鐮刀菌屬Fusarium、被孢霉屬M(fèi)ortierella呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，與微量元素Mn2+、Zn2+呈正相關(guān)；分子孢子菌屬Cladosporium、腐質(zhì)霉屬Humicola與速效磷、銨態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)，與Mn2+、Zn2+呈正相關(guān)。土壤中速效磷、銨態(tài)氮、S、Mn2+、Zn2+是影響華中五味子根際土壤真菌群落的主要肥力因子，說明這些土壤化學(xué)因子對(duì)于這些根際土壤真菌群落遺傳多樣性起著重要作用。這與王玉等[17]和楊俊博[28]的研究結(jié)果相似，土壤中的氮元素等對(duì)真菌多樣性有顯著影響，各個(gè)因子會(huì)顯著影響相關(guān)真菌群落。表明可以通過調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分水平，來改變?nèi)A中五味子根際土壤真菌群落組成和遺傳多樣性水平。

綜上所述，種植華中五味子后，植株生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)微量Fe3+、Mn2+、Zn2+、Pb營(yíng)養(yǎng)元素的需求量較大，導(dǎo)致根際土壤中Fe3+、Mn2+、Zn2+、Pb等元素的含量降低；隨華中五味子生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，植株根系分泌物以及枯落物導(dǎo)致根際土壤中銨態(tài)氮、速效磷、S等的含量顯著增加，提高了土壤的保肥能力和補(bǔ)給能力。又因土壤化學(xué)性質(zhì)的改變也會(huì)影響土壤真菌區(qū)系的變化，土壤中真菌群落的生理活動(dòng)與土壤環(huán)境中的化學(xué)性質(zhì)的含量密切相關(guān)，最終導(dǎo)致尖孢鐮刀菌屬Fusarium、分子孢子菌屬Cladosporium、腐質(zhì)霉屬Humicola等根際土壤真菌群落改變。