韓 筠

(廣東海洋大學(xué)數(shù)學(xué)與計算機學(xué)院，廣東 湛江 524088)

0 引 言

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，目前尚無根治方法。我國是糖尿病大國，截至2017年我國糖尿病人群約為1.14億，居世界首位，未來50年內(nèi)糖尿病及其并發(fā)癥仍將是我國一個嚴重的公共衛(wèi)生問題[1]。研究表明，良好的血糖監(jiān)測能夠有效的診斷和預(yù)防糖尿病的發(fā)生，減緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[2]。糖化血紅蛋白(HbA1c)是評價長期血糖水平的“金標準”，它不易受其他因素(進食、用藥等)的影響，能客觀反映高血糖狀態(tài)。因此，HbA1c的快速準確檢測對糖尿病篩查、診斷和治療都具有重要意義。目前的HbA1c臨床檢測方法較為繁瑣，不便于大人群的血糖篩查，研發(fā)快速簡便的HbA1c的檢測新方法具有重要意義。HbA1c是血液中葡萄糖與血紅蛋白發(fā)生非酶促糖化反映，經(jīng)不可逆重排后形成的，這一過程涉及一系列非酶促反應(yīng)(Maillard reactions，美拉德反應(yīng))[3]。在臨床實踐中，健康人的HbA1c含量大約在4.0%～6.0%，HbA1c>6.0%為糖尿病表型陽性的患者[4]。近紅外光(NIR)是介于可見光(Vis)和中紅外光(MIR)之間的電磁波，由分子振動的非諧振性使分子振動從基態(tài)向高能級躍遷時產(chǎn)生，反映含氫基團X-H(如C-H、N-H、O-H等)振動的倍頻和合頻吸收[5]。NIR技術(shù)是一項綠色環(huán)保的分析技術(shù)，對大多數(shù)類型的樣品，不需要進行預(yù)處理(或僅需簡單制樣)便可進行測量，具有檢測快速且無污染的優(yōu)勢，已成功應(yīng)用于很多領(lǐng)域[6-8]。由于葡萄糖和血紅蛋白(Hb)分子均含有含氫基團X-H，它們對近紅外光產(chǎn)生吸收，因此，NIR光譜已成功應(yīng)用于無試劑快速分析血液葡萄糖和Hb[6]。血紅蛋白被糖化的過程(美拉德反應(yīng))涉及了許多含氫基團X-H，它們對NIR產(chǎn)生吸收，所以，NIR具有分析HbA1c的理論依據(jù)。但由于HbA1c是糖化血紅蛋白相對于總血紅蛋白(Hb)的百分比，是一個相對性指標，其大小與光譜吸收值(吸光度)不具備直接的線性相關(guān)性，不滿足朗伯-比爾定律，在采用NIR光譜分析時，不能直接建立HbA1c與吸光度的定標預(yù)測模型，這對建模體系提出了挑戰(zhàn)。因此，到目前為止，采用NIR光譜直接定量分析HbA1c的相關(guān)研究尚少。文獻[3]基于NIR和折射率測量方法，研究了糖化血紅蛋白模擬溶液(配制不同葡萄糖濃度的血紅蛋白和白蛋白水溶液)的光學(xué)特性，還未直接應(yīng)用到直接測量糖化血紅蛋白(即HbA1c)。采用了一種間接分析方法：基于絕對性指標血紅蛋白(Hb)和血紅蛋白的絕對含量(Hb?HbA1c)的定量分析，實現(xiàn)相對性指標HbA1c的定量分析。由于血液樣品是包含有多組分和背景的復(fù)雜體系，其光譜中存在待測目標以外的吸收干擾及光譜測量本身的系統(tǒng)噪音干擾，因此，適當(dāng)?shù)墓庾V預(yù)處理是需要的。通過對比實驗，采用對人血液樣品取得良好預(yù)測效果的Savitzky-Golay(SG)平滑方法對光譜進行預(yù)處理。研究表明[7, 8]，特征波長篩選對NIR分析是非常重要的，它可以大大降低模型的復(fù)雜性同時提高模型的預(yù)測效果。采用移動窗口偏最小二乘(MW-PLS)和等間隔多元線性回歸(EC-MLR)兩種方法對Hb和Hb?HbA1c兩個指標進行波長篩選，以得到高精度的定量分析模型。

1 實驗和方法

1.1 實 驗

共收集到200份人外周血樣品，用雙蒸水配制成2倍溶血液樣品用于光譜測定。采用BC-3000Plus全自動血細胞分析儀(深圳麥瑞公司，中國)測量這些樣品的Hb值；采用ADAMSTM A1c HA-8160 糖化血紅蛋白自動分析儀(ARKRAY公司，日本)測量這些樣品的HbA1c值。將這些常規(guī)方法得到的測量值作為后面光譜分析的參考值。指標Hb和HbA1c的測量值統(tǒng)計分析總結(jié)在表1中，根據(jù)HbA1c臨床截斷值(6.0%)，陰性(正常對照)樣品有98份，陽性樣品有102份。

表1 指標Hb和HbA1c的測量值統(tǒng)計分析

采用XDS Rapid ContentTM型近紅外光柵光譜分析儀(FOSS公司，丹麥)和透射樣本附件進行光譜采集，探測器為Si(400～1100 nm)和PbS(1100～2498 nm)。在780～2498 nm范圍內(nèi)采集光譜，間隔為2 nm，共860個波長點，實驗室溫度為251℃，濕度為46%RH。

圖1 200個人溶血液樣品的近紅外光譜圖

1.2 定標、預(yù)測和檢驗過程

為了使所建立的模型具有好的穩(wěn)健性，采用多次建模的思路。具體步驟如下：首先，從200個樣品中隨機挑選出28個陰性樣品和32個陽性樣品作為檢驗樣品，余下的140個樣品作為建模樣品，檢驗樣品不參與建模過程；其次，將建模樣品中的70個陰性樣品和70個陽性樣品隨機劃分35個陰性樣品和35個陽性樣品到定標集，余下的作為預(yù)測集，這個過程重復(fù)100次，對每一次劃分都進行建模和優(yōu)化，將篩選出的100個模型的預(yù)測結(jié)果的平均值作為最終預(yù)測結(jié)果來篩選最優(yōu)模型；最后，用沒參與建模過程的檢驗樣品對優(yōu)選的模型進行重新檢驗，以確保模型的穩(wěn)定可靠。指標Hb和Hb?HbA1c采用相同的建模過程獨立地進行定量分析，通過測量這兩個指標可間接獲得相對百分比HbA1c的預(yù)測值。

1.3 MW-PLS方法

移動窗口偏最小二乘方法(MW-PLS)是一種性能良好，被廣泛使用的連續(xù)波長篩選方法[10]。它將N個連續(xù)的波長作為一個窗口，該窗口的位置和大小可以改變，在每個窗口都建立PLS模型，根據(jù)模型預(yù)測效果篩選最優(yōu)分析波段。該方法的參數(shù)有起始波長(B)，波長個數(shù)(N)和PLS因子個數(shù)(F)。B和F的設(shè)置如下：B∈{780,782,…,2498}，F(xiàn)∈{1,2,…,30}，為了減少程序耗時又不失代表性，N的設(shè)置如下：NHb∈{1,2,…,450}∪{460,470,…,860}，NHb?HbA1c∈{1,2,…,200}∪{215,230,…,860}。對定標集、預(yù)測集的每一次劃分，在每一個參數(shù)組合(B,N,F)確定的波長組合內(nèi)建立PLS模型，根據(jù)最小M_SEPAve選擇最優(yōu)波段。

1.4 EC-MLR方法

EC-MLR是一種選擇等距離離散波長組合的方法，它包括波長起點(B)、波長數(shù)(N)和波長間隔(G)三個參數(shù)，通過設(shè)置參數(shù)以移動窗口的模式選擇所有等間隔離散波長組合。根據(jù)各參數(shù)組合對應(yīng)的MLR預(yù)測效果確定篩選結(jié)果。EC-MLR方法的搜索范圍可以是全譜，也可以根據(jù)樣品的吸收特征篩選部分譜。本文采用的是在全譜區(qū)域進行搜索，B，N和G的設(shè)置如下：B∈{780, 782,…,2498}，N∈{1,2,…,50}，G∈{1,2,…,100}。對定標集、預(yù)測集的每一次劃分，在每一個參數(shù)組合(B,N,G)確定的波長組合內(nèi)建立MLR模型，根據(jù)最小M_SEPAve選擇最優(yōu)波長組合。

2 結(jié)果和討論

2.1 MW-PLS方法的結(jié)果

圖1是200個人溶血液樣品的近紅外光譜圖。作為比較，首先在全譜區(qū)建立Hb和Hb·HbA1c兩個指標的PLS模型。在建模之前，采用1階導(dǎo)數(shù)、3次多項式、13個平滑點的SG平滑模式對光譜進行預(yù)處理。模型的預(yù)測結(jié)果匯總在表2中，結(jié)果表明，Hb的預(yù)測值和臨床測量值有較高的相關(guān)性，但Hb·HbA1c的預(yù)測值和臨床測量值相關(guān)性不夠理想。此外，模型采用了860個波長，較為復(fù)雜。

為了降低模型的復(fù)雜度，同時提高預(yù)測精度，采用MW-PLS方法進行特征波長篩選。分別根據(jù)最小M_SEPAve值，篩選Hb和Hb·HbA1c的最優(yōu)MW-PLS模型，相應(yīng)參數(shù)和預(yù)測結(jié)果(M_SEPAve, M_RP,Ave, M_SEPSD, M_RP,SD)總結(jié)在表3中。結(jié)果表明，Hb的最優(yōu)MW-PLS模型對應(yīng)的起點波長(B)和波長個數(shù)(N)分別為948nm和413，相應(yīng)的波段為948～1772 nm；Hb·HbA1c的最優(yōu)MW-PLS模型對應(yīng)的B和N分別為1480nm和180，相應(yīng)的波段為1480～1838 nm。Hb的最優(yōu)模型所采用的波長個數(shù)(413)不足全譜波長個數(shù)(860)的一半，而Hb·HbA1c的最優(yōu)模型所采用的波長個數(shù)(180)不足全譜波長個數(shù)的四分之一，因此，模型的復(fù)雜度大大降低了。由表2和表3可以看出，與全譜區(qū)的最優(yōu)PLS模型相比，兩個指標的最優(yōu)MW-PLS模型對應(yīng)的預(yù)測均方根誤差平均值M_SEPAve均明顯降低了，尤其是對于指標Hb·HbA1c。

表2 指標Hb和Hb?HbA1c的全譜區(qū)PLS模型的預(yù)測效果

表3 指標Hb和Hb?HbA1c的最優(yōu)MW-PLS模型的預(yù)測效果

2.2 EC-MLR方法的結(jié)果

采用上面討論的EC-MLR方法選擇等間隔離散波長組合。得到的Hb的最優(yōu)模型所對應(yīng)的起點波長(B)，波長個數(shù)(N)和波長間隔(G)分別為1532nm，8和10，相應(yīng)的波長組合為1532、1552、1574、1594、1614、1634、1654和 1674 nm；Hb?HbA1c的最優(yōu)模型所對應(yīng)的B，N和G分別為1572nm，12和9，相應(yīng)的波長組合為1572、1590、1608、1626、1644、1662、1680、1698、1716、1734、1752和1770 nm。兩個指標最優(yōu)模型的預(yù)測結(jié)果總結(jié)在表4中。

由表3和表4可以看出，MW-PLS和EC-MLR兩種方法的預(yù)測結(jié)果是接近的。與最優(yōu)MW-PLS模型相比，最優(yōu)EC-MLR模型采用了更少的波長，Hb和Hb?HbA1c的最優(yōu)EC-MLR模型分別采用了8和12個波長，因此，模型復(fù)雜度顯著降低。值得注意的是，兩個指標的最優(yōu)EC-MLR模型所采用的等間隔離散組合波長均包含在最優(yōu)MW-PLS模型的波段內(nèi)。這表明，兩種方法對應(yīng)的光譜吸收區(qū)域是一致的，波長選擇是合理的。

表4 指標Hb和Hb·HbA1c的最優(yōu)EC-MLR模型的預(yù)測效果

2.3 模型檢驗

分別采用兩種方法的最優(yōu)模型計算60個檢驗樣品的Hb和Hb·HbA1c的預(yù)測值。其中，采用最優(yōu)MW-PLS模型得到的兩個指標的檢驗預(yù)測均方根誤差和預(yù)測相關(guān)系數(shù)(V_SEP、V_RP)分別為3.1 g L-1、0.966和0.60 g L-1、0.949；采用最優(yōu)EC-MLR模型得到的V_SEP和V_RP分別為3.4 g L-1、0.961和0.72 g L-1、0.940。結(jié)果表明，兩個模型均取得了較高的檢驗預(yù)測精度，兩個指標的預(yù)測值與臨床測量值均有很高的相關(guān)性。由于在建模過程中，考慮了模型的穩(wěn)健性(通過對定標集、預(yù)測集的多次劃分克服模型對部分樣品的依賴)，所以篩選出的模型對于隨機挑選出來的樣品也能取得較為理想的檢驗效果。

基于Hb和Hb·HbA1c的預(yù)測值可以計算出相對百分比HbA1c的預(yù)測值。MW-PLS方法得到的HbA1c的檢驗預(yù)測均方根誤差和預(yù)測相關(guān)系數(shù)(V_SEP、V_RP)分別為0.44%和0.918；EC-MLR方法得到的HbA1c的V_SEP和V_RP分別為0.50%和0.908。采用兩種方法算出的60個檢驗樣品的HbA1c的預(yù)測值和臨床測量值均高度相關(guān)。結(jié)果表明，通過NIR光譜同時定量分析兩個絕對性指標間接實現(xiàn)相對性指標的定量分析的方法是可行的，進一步證實了近紅外光譜定量模型建立前，特征波長的篩選是必要的。

3 結(jié) 論

基于指標Hb和HbA1c的內(nèi)在聯(lián)系，采用一種間接分析方法實現(xiàn)了近紅外光譜對HbA1c的測定。為了得到穩(wěn)定可靠的定量分析模型，采用MW-PLS和EC-MLR兩種方法，基于定標集和預(yù)測集的多種不同劃分，篩選Hb和Hb·HbA1c的特征波長。兩種方法所選出的波長模型均取得了理想的預(yù)測效果。其中，EC-MLR的最優(yōu)模型采用了較少的波長，且這些波長包含在MW-PLS最優(yōu)模型所采用的波段內(nèi)，表明兩種方法所對應(yīng)的光譜吸收區(qū)域是一致的，波長選擇是合理的。

進一步，由Hb和Hb·HbA1c的預(yù)測結(jié)果可算出HbA1c的預(yù)測值。結(jié)果表明兩種方法得到的HbA1c的預(yù)測值跟臨床測量值都有很高的相關(guān)性。因此，采用NIR光譜間接測定糖化血紅蛋白(HbA1c)是可行的。與傳統(tǒng)的HbA1c的檢測方法相比，基于NIR光譜的檢測技術(shù)，具有簡便快速、精度適中、無需化學(xué)試劑等優(yōu)點，是非常適合于糖尿病大人群篩查的一種簡便新技術(shù)。這對于預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，提高人口素質(zhì)具有重要意義，具有廣闊的應(yīng)用前景。此外，這種基于兩個絕對性指標的同時快速測定間接實現(xiàn)相對性指標的快速測定的技術(shù)可以應(yīng)用到近紅外光譜分析其他領(lǐng)域的相對性指標中，這在一定程度上拓寬了近紅外光譜技術(shù)的應(yīng)用范圍。