中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室技師 廣東 廣州 510089

一、實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介

多年以來(lái),人體小腸潘氏細(xì)胞(Panrth cell)顆粒的顯色記載及圖片如蓬萊仙閣,少有陳跡。書本上只提及,網(wǎng)絡(luò)上罕見。本校的教學(xué)庫(kù)因多為動(dòng)物標(biāo)本,顆粒不清。較其原因,抑或所取非源?又或染色方法有異?對(duì)醫(yī)學(xué)教學(xué)造成很大影響。

潘氏細(xì)胞(Paneth cell)乃小腸腺內(nèi)一種特征性細(xì)胞,位于腺之底部,細(xì)胞呈錐體形,頂部胞質(zhì)充滿粗大嗜酸性的分泌顆粒。其功能類似于中性粒細(xì)胞,在細(xì)菌或細(xì)菌抗原侵犯機(jī)體時(shí),潘氏細(xì)胞分泌抗菌分子,如防御素到小腸管腔的絨毛,以助于維持胃腸道屏障,防衛(wèi)微生物的侵犯而感染。

為探討細(xì)胞形態(tài),印證史實(shí)。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)年解剖小鼠,麻醉貓豬,均只得輪廓。一次偶然機(jī)會(huì),本校法醫(yī)系接到某衛(wèi)生局報(bào)案。稱某人因?yàn)榈巫⑺劳觥９嗜〉貌牧?以HE染色方法增補(bǔ)程序,開展探索。結(jié)果讓人驚訝。神秘之潘氏細(xì)胞形態(tài)顆粒顯露無(wú)遺,層次分明。填補(bǔ)了本校《組織與胚胎學(xué)》教學(xué)玻片得空白。

二、實(shí)驗(yàn)技術(shù)詳述

本次實(shí)驗(yàn)取材于新死亡之人體空腸段(死者年輕,因藥物過(guò)敏身亡)。實(shí)驗(yàn)步驟分取材、固定、固定后實(shí)驗(yàn)室修塊、脫水、包埋、切片、烤片,然后染色。

取材：用手術(shù)刀片按橫切面切取空腸,厚度為1cm,分多段切取。置于固定液中固定。

固定：新鮮組織必須經(jīng)過(guò)固定,保持細(xì)胞與生活時(shí)的形態(tài),防止自溶與腐敗。才可清晰顯示組織結(jié)構(gòu)形態(tài)。常用固定劑為10%福爾馬林液(甲醛HCHO)。甲醛可通過(guò)蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用。溶液配制：1份甲醛加9份水。固定時(shí)間為24小時(shí)。24小時(shí)后按實(shí)驗(yàn)包埋要求進(jìn)行修塊。切取小腸組織橫切面,厚度0.5cm,置于包埋盒中。組織再固定24小時(shí)后開始組織脫水。

組織脫水：脫水的目的利用脫水劑能與水無(wú)限度相混合的原理,把組織內(nèi)水分逐步置換出來(lái),使組織處于無(wú)水狀態(tài)。然后經(jīng)過(guò)透明劑,把石蠟引進(jìn)組織內(nèi),支撐起組織結(jié)構(gòu),以便后續(xù)的切片。脫水劑要求既能與水無(wú)限度相混合,又要和透明劑完全相混溶。透明劑又必須能與石蠟混溶。故選擇酒精做脫水劑、二甲苯作透明劑。這是前人的智慧結(jié)晶。

組織脫水流程：

組織包埋：組織經(jīng)脫水浸蠟后進(jìn)入包埋程序。包埋機(jī)具有冷凍和溶蠟功能。使用前提前2小時(shí)開機(jī),石蠟完全融化后開始包埋。將脫水后組織合置于蠟缸內(nèi),使浸有石蠟組織融化。包埋模置于蠟嘴下,添蠟,組織塊平放于模內(nèi),切面潮下擺正壓平,移開置冷凍區(qū)穩(wěn)固組織。將模再移至蠟嘴,加包埋合蓋,添蠟至滿,再移至冷卻,使蠟液凝固。包埋模因冷凍石蠟收縮脫離。

組織切片：修整組織蠟塊邊緣。將組織蠟塊置于冰塊上冷凍。此時(shí)蠟塊變硬。將蠟塊嵌入切片機(jī)夾內(nèi),先粗切,削平組織塊面。調(diào)節(jié)切片厚度,在3～5微米之內(nèi),然后切片,移切片于攤片機(jī)內(nèi),修整組織片。載玻片撈片。置于48度烤箱,烤片12小時(shí)以上。

組織染色：根據(jù)HE染色原理,蘇木素能使細(xì)胞核藍(lán)染,伊紅讓細(xì)胞漿紅染,可清晰反映細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。編排組織染色程序時(shí),再次利用二甲苯與酒精互溶的原理及其特性。用二甲苯去除石蠟,再用酒精去除二甲苯,讓組織再次回到水環(huán)境開展染色。本次染色改良了HE染色步驟。增加了氨水復(fù)染。清晰反映了潘氏細(xì)胞及其顆粒結(jié)構(gòu)。

染色步驟如下：

1.組織經(jīng)3缸二甲苯脫蠟,再經(jīng)兩缸無(wú)水酒精、95%、90%、80%、70%酒精脫二甲苯。過(guò)水。

2.Harris蘇木精染色8分鐘。蒸餾水水洗。

3.1%鹽酸酒精分化3秒鐘。

4.流水沖洗半小時(shí),組織呈淺藍(lán)時(shí)終止。

5.0.5%氨水組織復(fù)染1分鐘。

6.伊紅染色5分鐘。水洗3秒。

7.按70%,80%,90%,95%乙醇脫水,每缸10秒。

8.100%,100%酒精脫水。各20秒。

9.石碳酸二甲苯處理5秒。

10.二甲苯1,二甲苯2,二甲苯3各透明1分鐘。

11.中性樹膠固封。

三、結(jié)果(如下圖)

潘氏細(xì)胞呈錐體形,分布于小腸腺底部,頂部胞質(zhì)充滿粗大嗜酸性分泌顆粒。

四、特色與創(chuàng)新

本次實(shí)驗(yàn)組織來(lái)源于人體。采用改良HE染色方法,把控各步驟染色時(shí)間。取得可喜成果。成功顯示Paneth細(xì)胞及其分泌的顆粒,完善教學(xué)資料。實(shí)驗(yàn)采用改良傳統(tǒng)HE染色方法,染色穩(wěn)定,可長(zhǎng)久保存。

五、技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域

本次實(shí)驗(yàn)以人體組織為標(biāo)本,顯示空腸小腸腺Panrth細(xì)胞形態(tài)及其分泌的顆粒。改變了以前只有書本圖示的困固。本實(shí)驗(yàn)成果可用于《人體解剖學(xué)》、《組織學(xué)與胚胎學(xué)》及《病理學(xué)》、《法醫(yī)學(xué)》的教學(xué),協(xié)助科研人員對(duì)人體小腸功能的各項(xiàng)研究。