寧夏泰益欣生物科技有限公司 寧夏 銀川 750205

紅霉素[1](erythromycin，Er)是結(jié)構(gòu)為十四元環(huán)內(nèi)酯類的抗生素，經(jīng)紅色鏈霉菌經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生，主要成分為紅霉素A、紅霉素B、紅霉素C、紅霉素D等。紅霉素因其特殊的化學結(jié)構(gòu)，具有良好的抗菌活性，對革蘭氏陽/陰性菌都具有的抑制作用[2]，目前為熱門研發(fā)對象。

本文將通過搖瓶試驗探究加入不同濃度的甘氨酸、不同周期加入甘氨酸對紅霉素發(fā)酵的作用，并檢測不同周期發(fā)酵液中紅霉素C的含量變化，確定加入甘氨酸可以降低發(fā)酵液中紅霉素C的含量，提高紅霉素發(fā)酵效價。

1 儀器與材料

1.1 儀器及原料

高效液相色譜儀：海能儀器；數(shù)顯粘度計，上海儀器有限公司；

淀粉，購自濟南鑫聚成化工科技有限公司；豆粉，購自利辛縣聚鑫農(nóng)業(yè)有限公司；糊精，購自濟南聯(lián)如化工有限公司；玉米漿：購自金維藥業(yè)有限公司；硫酸銨，購自上海諾翔化工科技有限公司；輕質(zhì)碳酸鈣，購自石家莊托瑪琳礦產(chǎn)品有限公司；硫酸鎂，購自共創(chuàng)化工有限公司；氯化鈷，購自蘇州斌順化工限公司。

1.2 菌種及培養(yǎng)基 紅色鏈霉菌為2019年公司研發(fā)中心篩選的高單位菌株，編號為20190814

搖瓶培養(yǎng)基組成為：氯化鈷0.02%，淀粉0.3%，碳酸鈣0.8%，玉米漿0.3%，硫酸銨0.2%，硫酸鎂0.1%，適量消沫劑，其余為水，以重量體積比計；

2 實驗方法

2.1 培養(yǎng)過程 將紅色鏈霉菌孢子接種到盛有120ml培養(yǎng)基的搖瓶中，在33℃條件下振蕩發(fā)酵160小時。

2.2 發(fā)酵數(shù)據(jù)測定

紅霉素發(fā)酵液效價測定：硫酸水解法。

紅霉素組分檢測：液相法檢測。

不銹鋼色譜柱：流動相：0.025 mol/L的K2HPO4溶液：乙睛=50∶40，流速：1.mL/min；進樣量80μL。

2.3 實驗結(jié)果

2.3.1 確定搖瓶培養(yǎng)基加入甘氨酸的最適濃度 在搖瓶培養(yǎng)基中加入濃度為0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%的甘氨酸作為實驗組，不添加甘氨酸的作為對照組，以發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵瓶中效價高低判斷甘氨酸的最適添加量。

2.3.2 確定向搖瓶中加入甘氨酸的最適時間 在發(fā)酵周期為40，60，80，100，120和140h時分別添加0.05%的甘氨酸作為實驗組，不添加甘氨酸的作為對照組，以培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵瓶中效價高低判斷甘氨酸的加入周期。

3 結(jié)果與分析

3.1 加入不同濃度甘氨酸對紅霉發(fā)酵的影響 向紅霉素培養(yǎng)基中添加一定體積不同濃度的甘氨酸，觀察紅霉素發(fā)酵結(jié)束后的效價，結(jié)果如下：

圖1 加入不同濃度的甘氨酸對紅霉素發(fā)酵的影響

由圖1知：在紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)的起始階段，向培養(yǎng)基中加入不同濃度的甘氨酸都將有利于紅色鏈霉菌生產(chǎn)紅霉素，當加入甘氨酸濃度為.05%時，發(fā)酵效價達到8796U/mL，比對照組發(fā)酵效價高出15.3%。

3.2 不同發(fā)酵周期加入甘氨酸對紅霉素效價的影響 在紅霉素搖瓶培養(yǎng)過程中，以不同發(fā)酵周期加入0.05%的甘氨酸為實驗組，以不添加甘氨酸的紅霉素搖瓶發(fā)酵作為對照組，觀察不同發(fā)酵周期添加甘氨酸對紅霉素發(fā)酵效價的影響，結(jié)果如下圖所示：

圖2 不同發(fā)酵周期添加甘氨酸對紅霉素影響

由圖2可知：不同發(fā)酵周期加入0.05%的甘氨酸，對紅霉素的發(fā)酵影響不同。不同發(fā)酵時間段添加甘氨酸有利于紅霉素發(fā)酵效價提升，但在發(fā)酵80小時添加甘氨酸，將最利于紅色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)紅霉。

3.3 加入甘氨酸對發(fā)酵過程中紅霉素C的影響 在搖瓶培養(yǎng)紅霉素發(fā)酵時，根據(jù)不同的時間點取樣，用液相法分別檢測添加甘氨酸、不添加甘氨酸發(fā)酵液中紅霉素C的含量變化，其結(jié)果如圖3所示：

圖3 發(fā)酵過程中紅霉素C含量變化

由圖3可知，在60小時后，添加甘氨酸的實驗組與不添加甘氨酸的對照組紅霉素C的含量有較大差距，推測是實驗組添加甘氨酸，促進紅霉素C向紅霉素A轉(zhuǎn)化，使實驗組紅霉素C含量低于對照組。

3 結(jié)論

在紅霉素搖瓶實驗過程中，添加不同的含量的甘氨酸，都將促進紅色鏈霉菌生產(chǎn)紅霉素，但是不同周期添加不同含量的甘氨酸對紅色鏈霉菌生產(chǎn)紅霉素的效果不一樣，在紅霉素發(fā)酵60小時以后添加5%的甘氨酸為紅色鏈霉菌生產(chǎn)紅霉素的最佳條件。發(fā)酵過程中添加甘氨酸可調(diào)控紅霉素C的含量，根據(jù)實驗結(jié)果推測：在一定條件下紅霉素發(fā)酵添加甘氨酸有利于紅霉素C轉(zhuǎn)化為紅霉素A。