黃志鵬,吳海寧,唐秀梅,賀梁瓊,韓柱強,鐘瑞春,熊發(fā)前,劉 菁,唐榮華,蔣 菁

(廣西農業(yè)科學院經濟作物研究所,廣西 南寧530007)

中國是世界最主要的化肥生產與施用大國[1],化肥的過量施用已造成作物品質下降、肥料利用率低[2-3]及土壤細菌多樣性和活性下降[4]等諸多不利影響。 目前,農業(yè)生產集約化水平不斷提高,土壤養(yǎng)分平衡盈余,化肥減施是今后的必然趨勢[5-6]?；ㄉ俏覈匾挠土虾徒洕魑?其單產近年來徘徊不前,為了維持、提高產量,過量施肥普遍存在,不僅提高了生產成本,而且引發(fā)了諸多環(huán)境問題[5,7]。 前人研究表明,適量減施化肥對作物產量、品質無明顯負向影響[8-9],開展化肥減施相關研究對花生合理施肥具有重要的實踐意義。

化肥可迅速補充和及時滿足作物對養(yǎng)分的需求,對作物產量的貢獻起關鍵性作用[3],并通過對土壤營養(yǎng)和環(huán)境條件的改變,直接或間接影響土壤微生物區(qū)系[6,10-11]。 細菌約占土壤微生物數量的70%～90%,在土壤養(yǎng)分循環(huán)及維持農田微生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用[12],其多樣性及群落組成在一定程度上決定土壤肥力的高低[13]。 根際是土壤微生物最活躍的區(qū)域,土壤細菌比真菌和放線菌更偏好在根際區(qū)域生長并且對肥料的敏感性更高[14],其細菌群落結構和多樣性易受施肥條件的影響[10,15-16]。 前人關于肥料對土壤細菌影響的報道較多,主要集中在化肥單獨及其與各種有機肥料配合施用對土壤細菌數量、群落結構及多樣性的影響[16-18],關于化肥減施對花生根際細菌群落結構影響的研究報道較少。 因此,本文以單作花生為研究對象,采用Illumina Miseq測序平臺,對化肥梯度減施條件下的根際土壤進行16S r RNA 高通量測序分析,研究化肥減施對根際土壤細菌群落結構和多樣性的影響,為花生減肥增效提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在廣西農業(yè)科學院武鳴里建科研基地進行,土壤理化性質:有機質17.7g/kg、全氮1.03g/kg、全磷0.63g/kg、全鉀2.5g/kg、水解性氮85mg/kg、有效磷12.6mg/kg、速效鉀138 mg/kg、交換性鈣7.7 cmol/kg、p H 值6.8。

1.2 試驗方案

選用桂花1026為供試材料,設5個化肥減施梯度處理:施用三元復合化肥(N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15)450 kg/hm2(F1:習慣施肥,化肥用量設為100%);施用三元復合肥382.5 kg/hm2(F2:化肥減施15%);施用三元復合肥315kg/hm2(F3:化肥減施30%);施用三元復合肥225 kg/hm2(F4:化肥減施50%);施用三元復合肥0 kg/hm2(F5:化肥減施100%,即不施)。 采用寬窄行起壟種植,壟距90cm,其中:寬行距55cm、窄行距35cm,穴距16cm,每穴1粒,隨機區(qū)組設計,3次重復,田間管理與一般花生高產田相同。

1.3 根際土壤樣品的采集

在結莢期采集各處理植株的根際土壤:隨機選取正常生長的花生植株,拔起后抖落根部表土,用無菌毛刷將附著在根系表面1～4 mm 的土壤刷入無菌離心管中,每處理小區(qū)取5份根際土壤充分混合后作為該小區(qū)的根際土樣品,保存于-80℃冰箱,用于根際土壤細菌高通量測序分析。

1.4 根際土壤細菌多樣性分析

1.4.1 土壤總DNA 提取及PCR 擴增程序

土壤總DNA使用FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒,每個根際土樣品稱取0.5 g鮮土,依照試劑盒說明提取土壤總DNA。 DNA 濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質量。

使用土壤細菌16S r RNA(V3-V4)基因的通用PCR 引物:上游引物5’-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA -3’; 下 游 引 物5’-GTGGACTACHVGGGTWTCTAA-3’,進行擴增,PCR 反應體系:模板DNA 20 ng,正反向引物(5μmol/L)各0.8μL,BSA(2 ng/μL)2.4μL,2×Taq Plus Master Mix 10μL,dd H2O 6μL,總 體 積20μL。PCR 擴增程序:95℃5 min;94℃30s,55℃30s,72℃45s,32個循環(huán);72℃8min;4℃保存。 擴增產物于1%的瓊脂糖凝膠中電泳(120 V,30 min)并使用凝膠成像系統(tǒng)檢測后經膠純化試劑盒進行純化回收。 MiSeq文庫構建、上機測序和數據分析由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.4.2 數據處理

對原始數據進行過濾、拼接、去除嵌合體,得到最終有效數據(Effective Tags)。 使用QIIME(version 1.8.0)軟件中的UCLUST 對Tags在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU,并基于Silva(細菌)和UNITE(真菌)分類學數據庫對OTU 進行分類學注釋。 將OTU 的代表序列與微生物參考數據庫進行比對可得到每個OTU 對應的物種分類信息,進而在各水平(phylum,class,order,family,genus,species)統(tǒng)計各樣品群落組成,利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種豐度表,再利用R 語言工具繪制成樣品各分類學水平下的群落結構圖。 使用Mothur(version 1.30)軟件,對樣品Alpha多樣性指數進行評估,用QIIME軟件進行Beta多樣性(Beta diversity)分析。 部分數據采用Excel 2017和DPS(v7.05)進行處理分析,多重比較采用LSD 法[13]。

2 結果與分析

2.1 根際土壤細菌高通量測序結果

運用Illumina MiSeq技術對15個花生根際土壤樣品的細菌進行高通量測序分析,各處理原始序列數、優(yōu)化序列數、有效序列數、覆蓋率指數統(tǒng)計分析詳見表1,覆蓋率指數均大于0.99,說明制備的MiSeq文庫覆蓋了土壤樣品中99%以上的細菌類群,庫容足夠大,能客觀反映土壤樣品中細菌的真實信息。 稀釋性曲線(Rarefaction Curve)用于驗證測序數據量是否足以反映樣品中的物種多樣性,隨著測序數據量的增大,樣品的稀釋曲線(圖1)趨于平坦,說明測序結果基本覆蓋了樣品中絕大多數細菌的生物學信息,可用于后續(xù)分析。

2.2 根際土壤細菌群落豐度與多樣性指數

各處理根際土壤的OTUs和Alpha多樣性指數(表2)分析表明:習慣施肥(F1)和減施處理(F2、F3、F4)土壤的OTUs、菌群物種豐度指數(Ace、Chao1)明顯大于不施肥處理(F5),F4(減施50%)處理條件下的菌群物種豐度均為最高并顯著大于不施肥處理;各處理土壤的Simpson指數隨化肥用量的減小呈降低趨勢,Shannon指數卻隨化肥用量的減小而增大,不施肥土壤的菌群物種多樣性指數(Simpson、Shannon)與習慣施肥處理間顯著差異,但不施肥處理土壤的多樣性指數與各減施處理間無顯著差異。 以上結果說明,習慣施肥提高了花生根際土壤菌群物種豐度但降低其多樣性,化肥減施在增加土壤菌群物種豐度的同時多樣性無變化。 化肥減施50%處理條件下,花生根際土壤菌群物種豐度最高,并且其群落多樣性與不施肥土壤類似。

表1 不同處理測序結果Table 1 Sequencing results of the treatments

表2 不同處理細菌群落豐度與多樣性指數Table 2 Bacterial community richness and diversity indices relative to treatments

圖1 不同土壤樣品OTUs的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of the OTUs number at 97%similarity for different soil samples

2.3 根際土壤細菌群落組成

細菌16S r DNA 高通量測序序列經物種注釋后共獲得49個門、101個綱、200個目、360個科和552個屬類細菌。 圖2所示,在門水平上,F1、F2、F3、F4和F5處理相對豐度排名前10的細菌分別占細菌總數的97.97%、97.63%、97.52%、97.15%和97.86%,其中優(yōu)勢菌群為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes),各處理的平均相對豐度分別為38.76%、17.41%、12.53%、10.93%和6.97%。在屬水平上,F1、F2、F3、F4和F5相對豐度排名前10的細菌分別占細菌總數的23.98%、25.25%、25.34%、24.23%和25.03%,其中優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)、Haliangium、硝化螺旋菌屬(Nitrospira)、Candidatus_Solibacter、H16、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、RB41,各處理平均相對豐度分別為5.70%、3.40%、3.02%、2.11%、2.10%、2.06%、1.97%、1.91%。

各處理的菌群相對豐度顯著性差異分析表明:F2與F3在門和屬水平上的細菌群落構成差異不顯著,F5 與F4 間的差異亦不顯著(表3)。F1與F5處理間菌群相對豐度差異顯著的門屬分別為83個,F1與F4間菌群相對豐度差異顯著的門屬分別為65個,其余處理間菌群相對豐度差異顯著的門屬均少于3個。 結果說明,習慣施肥能顯著改變根際土壤細菌在門和屬水平上群落組成和結構,少量(15%)和中量(30%)減施化肥明顯影響根際土壤細菌的群落組成和結構,大量減施化肥(50%)則對根際土壤細菌的群落組成和結構影響較小。

圖2 不同土壤樣品根際細菌在門水平(A)和屬水平(B)上的優(yōu)勢物種豐度圖Fig.2 Dominant species abundance map at the phylum(A)and genus (B)levels relative to soil samples

表3 不同處理間相對豐度達到差異顯著的細菌門屬列表Table 3 List of soil bacterial phylumgenera with significant difference between treatments

2.4 根際土壤細菌的Venn圖分析

習慣、減施、不施三種化肥施用方式總OTU數分別為2120、2136 和2095 個,共 同 包含的OTU 有2081個(圖3)。 在OTU 數量種類方面,減施肥料處理不僅包含習慣施肥和不施肥,并擁有2個代表特有細菌屬的獨特OTU。 結果說明,化肥減施條件下的根際土壤能兼容不同類型細菌的生存需求,增加根際土壤細菌的組成種類。

圖3 根際土壤細菌OTUs數量Venn圖Fig.3 Venn diagram of the No.of bacterial OTUs in rhizosphere soil

圖4 基于非度量多維標定法(NMDS)(A)和非加權組平均法(UPGMA)(B)的群落結構分析Fig.4 Community structure analysis based on NMDS (A) and UPGMA (B)

2.5 根際土壤細菌群落的相似性分析

采用非度量多維標定法(NMDS)和非加權組平均法(UPGMA)對15個樣本的花生根際土壤細菌進行分析,研究不同處理間細菌群落結構和物種組成的相似性。 NMDS排序結果(圖4A)顯示,細菌群落結構按化肥施用方式分為3個組群,每種化肥施用方式的土壤細菌群落分別聚為1個組群,表明習慣、減施、不施處理間的細菌群落結構有較明顯的差異。 UPGMA 分析表明(圖4B),除個別樣品外,細菌群落物種組成分為兩大類,即習慣處理與減施、不施處理,說明習慣施肥使菌群物種組成發(fā)生明顯變化;F2、F3處理被聚為1個分支,F4、F5處理被聚為另外一個1個分支,說明F4與F5有較高的菌群相似性。 結果說明,施肥能明顯改變細菌群落結構和物種組成,減施處理的菌群結構和物種組成介于習慣施肥與不施肥處理之間,隨減施量的提高,土壤菌群物種組成逐步趨同于不施處理。

3 討 論

土壤微生物組成和功能直接受養(yǎng)分的影響[19],土壤中細菌是陸地生態(tài)系統(tǒng)中生物多樣性的主要代表,與碳固存、營養(yǎng)元素循環(huán)等生態(tài)系統(tǒng)功能密切相關[20]。 施肥是維持土壤肥力的重要措施,無機肥能直接改變土壤速效養(yǎng)分含量[18]。 化肥施用對不同生態(tài)系統(tǒng)土壤細菌群落組成和多樣性有不同的影響[6,9,12-13,16]。 本研究中,與不施肥處理相比,習慣施肥能明顯改變花生根際土壤的菌群物種豐度和多樣性,這與孫瑞波等[21]在砂姜黑土和荀衛(wèi)兵[16]在旱地紅壤上的研究結果相似,但亦有研究得出不同結論[22],其原因可能與化肥種類、土壤類型和用量等因素有關[23]。 化肥減施作為一種短期的無機肥施用管理措施,能使根際土壤細菌的群落結構和多樣性產生可被觀察到的變化,這與李楊[17]、Guo等[24]的研究結果類似。 對比習慣施肥,化肥減施增加了菌群物種豐度,隨著減施量的增大,根際土壤細菌多樣性也隨之提高,這與吳海寧等[25]對單作花生的研究類似。 化肥減施50%條件下,花生根際土壤菌群物種豐度最高并顯著大于不施肥處理,其菌群多樣性與不施肥處理差距很小但顯著大于習慣施肥處理,說明適宜的化肥減施水平有利于菌群豐度與多樣性的提高[22]。

本研究中,與不施肥處理相比,化肥習慣施用能顯著改變根際土壤細菌在門和屬水平上的群落組成和結構,兩者間相對豐度排名前10且差異顯著的細菌門屬分別為83個。 土壤p H 被認為是影響土壤微生物群落演替變化的最主要因子[16],N-P-K 復合肥的大量使用會導致土壤酸化改變[12],可能是土壤細菌群落結構發(fā)生顯著變化的原因,這也與孫瑞波[21]、岑劍[23]等研究結果類似。 本試驗中,少量(15%)、中量(30%)和大量(50%)減施化肥處理間的群落構成差異不大,即肥料用量對土壤細菌群落構成影響不大,與廖莎[26]的研究結果類似。 大量減施化肥條件下的根際土壤細菌群落構成與不施肥處理間無顯著差異,這可能與大量減施化肥使土壤養(yǎng)分含量處于相對均衡狀態(tài)有關,尚需深入研究。

本研究中,減施條件下的根際土壤能兼容不同類型細菌的生存需求,在組成種類方面,減施肥料處理不僅包含習慣施肥和不施肥處理,并擁有2個代表特有細菌屬的獨特OTU。 化肥減施在降低施肥對根際土壤菌群影響的同時仍可滿足不同種類細菌生存所需的養(yǎng)分,在增加菌群豐度,保持其多樣性方面的效果明顯。

4 結 論

習慣施肥顯著改變了根際土壤細菌的群落組成和結構,提高了花生根際土壤的菌群物種豐度但多樣性降低;化肥減施在進一步增加菌群豐度的同時維持其原有多樣性,化肥減施50%條件下,花生根際土壤菌群豐度最高,其群落構成和多樣性與不施化肥土壤類似。