張紹平，徐 怡

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院綦江醫(yī)院肝膽外科，重慶 401420)

膽囊癌是一種高侵襲性惡性腫瘤，盡管近年來膽囊癌的診治取得了巨大進展，但是患者5年生存率仍不高[1],因此亟需尋找新的生物學標志物及潛在治療靶點。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度大于200個核苷酸的非蛋白編碼轉(zhuǎn)錄子，在染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)等多方面發(fā)揮作用。lncRNA參與了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，與癌細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡等多種生物學行為有關。DILC是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型lncRNA，DILC在不同組織中發(fā)揮的作用不同，在肝癌、膀胱癌和結直腸癌中發(fā)揮抑癌基因作用[2-4]，在膽囊癌中發(fā)揮癌基因作用[5]。LIANG等[5]發(fā)現(xiàn)DILC在膽囊癌組織中表達上調(diào)，可以促進癌細胞增殖和侵襲。DILC與膽囊癌患者預后的關系如何，既往鮮有報道。本研究旨在觀察DILC在膽囊癌組織中的表達，并探討其與臨床病理特征及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取80例膽囊癌組織標本(膽囊癌組)和30例慢性膽囊炎組織標本(對照組)，均于2011年1月至2018年12月在重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院綦江醫(yī)院接受診治。膽囊癌患者80例，男28例，女52例；年齡28～72歲，平均(62.02±10.32)歲，術前均未接受過放療、化療或免疫治療。術后以電話和門診方式對膽囊癌患者進行隨訪，每3個月隨訪1次，隨訪時進行影像學檢查。獲得生存情況、復發(fā)或轉(zhuǎn)移情況等內(nèi)容。隨訪時間截止至2019年6月。對照組患者30例，男12例，女18例；年齡31～58歲，平均(49.35±6.37)歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.2 實時熒光定量PCR法檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測組織中DILC的表達。PCR步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。用TRIzol試劑(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)和AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Life Technologies公司)提取膽囊癌和慢性膽囊炎組織中總RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用2×SYBR Green PCR Mastermix試劑盒(美國Life Technologies公司)檢測DILC相對表達量。本研究引物均由蘇州泓迅生物科技股份有限公司設計并提供。DILC：上游5′-CGCACAGAGCAAAGCCATTT-3′；下游5′-GCAAGGGGCTAGAAGAAGGG-3′。內(nèi)參β-actin：上游5′-GGCCCAGAATGCAGTTCGCCTT-3′；下游5′-AATGGCACCCTGCTCACGCA-3′。PCR反應條件為：95 ℃ 20 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。用2-ΔΔCq法計算DILC相對表達量。以DILC表達量的中位數(shù)為截斷值，將膽囊癌患者分為高表達組和低表達組。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染和侵襲、遷移實驗

膽囊癌細胞GBC-SD和人膽囊上皮細胞HGBEC購于寧波明舟生物科技有限公司，將GBC-SD細胞分為轉(zhuǎn)染組和陰性對照組。當細胞生長融合度達到50%時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染組加入DILC siRNA(5′-GGGCTTCAATTTACAAGCATT-3′)，陰性對照組加入無關序列(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)。siRNA序列由上海吉馬制藥公司合成。操作步驟嚴格按照Lipofectamine 2000試劑盒(美國Sigma公司)說明書進行。細胞均置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。細胞融合度達80%時收集細胞，用實時熒光定量PCR法檢測DILC的表達水平。用Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力，試劑盒購于上海研拓生物科技有限公司，細胞培養(yǎng)24 h后顯微鏡下計算穿膜次數(shù)，隨機取10個視野，取平均值[6]；用細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力，細胞培養(yǎng)24 h后顯微鏡下取5個視野，測量劃痕兩側(cè)細胞間距取平均值[6]。實驗均重復3次，取平均值作為結果。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 膽囊癌組織和膽囊癌細胞中DILC的相對表達量

膽囊癌組DILC相對表達量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=16.899，P<0.001)。GBC-SD細胞DILC相對表達量明顯高于HGBEC細胞，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.265，P<0.001)。見封三圖1。

2.2 DILC表達與臨床、病理特征的關系

高表達組T分期為T3—T4期、TNM分期為Ⅲ—Ⅳ期的占比明顯高于低表達組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 DILC表達與臨床特征的關系 例

2.3 膽囊癌患者的生存分析

80例患者隨訪5～102個月，中位隨訪時間為45個月。隨訪期間57例患者死亡，占71.25%，其中52例因腫瘤復發(fā)死亡，5例由于術后合并感染等非腫瘤因素死亡(作刪失數(shù)據(jù)處理)。80例膽囊癌患者術后生存時間為6～98個月，平均(28.4±5.34)個月。1年、2年、3年、5年生存率分別為：52.50%、36.25%、32.50%、22.50%。見封三圖2。

2.4 膽囊癌患者生存預后的COX多因素分析

多因素分析結果顯示，T分期(T3—T4)、淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM分期(Ⅲ—Ⅳ)、DILC高表達是膽囊癌患者不良預后(生存時間)的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 膽囊癌患者生存預后的單因素和COX多因素分析

2.5 DILC對細胞侵襲和遷移的影響

轉(zhuǎn)染組侵襲細胞數(shù)為(120.32±35.69)個·視野-1，明顯低于陰性對照組的(286.33±89.75)個·視野-1(P<0.001)，見封三圖3。轉(zhuǎn)染組細胞遷移距離為(6.32±0.55)pixel，明顯低于陰性對照組的(16.02±0.96)pixel(P<0.001)，見封三圖4。

3 討論

膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病隱匿，臨床癥狀不典型，患者預后較差[7]。既往研究[8]顯示，膽囊癌患者5年生存率約5%，平均生存期13.2～19個月。本研究80例患者5年生存率為22.5%，術后生存時間為6～98個月，平均(28.4±5.34)個月。生存時間的延長可能與膽囊癌診治手段的提高有關，但其總體生存時間仍不能令人滿意。

膽囊癌發(fā)病的生物學機制現(xiàn)在并未完全明確。LncRNA在膽囊癌中的作用越來越被重視，lncRNA與膽囊癌細胞增殖、侵襲、遷移、自噬和化療敏感性等有關[9-11]，可能會成為膽囊癌早期診斷和預后判斷的生物學標志物，是潛在的治療靶點[12]。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA DILC與膽囊癌患者的腫瘤分期和生存預后密切相關。

DILC在多種癌癥中異常表達，DILC發(fā)揮的生物學作用具有組織特異性。MA等[3]發(fā)現(xiàn)，DILC可能通過抑制STAT3信號通路抑制膀胱癌細胞的侵襲。在腎透明細胞癌的研究中，ZHANG等[13]發(fā)現(xiàn)DILC可能通過PTEN/AKT信號通路抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲。DILC也能通過IL-6/STAT3信號抑制結腸癌進展[2]。在膽囊癌中，DILC可能發(fā)揮癌基因作用。LIANG等[5]發(fā)現(xiàn)DILC在膽囊癌組織中表達上調(diào)，本研究結果與之一致，提示DILC在膽囊癌中發(fā)揮癌基因作用。另，本研究發(fā)現(xiàn)，高表達組T分期為T3—T4期、TNM分期為Ⅲ—Ⅳ期的占比明顯高于低表達組(P<0.05)，提示DILC與腫瘤浸潤深度有關。影響膽囊癌預后的因素有很多，本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤分期和淋巴結轉(zhuǎn)移均與膽囊癌患者生存時間有關，這與既往報道[14-15]一致。DILC高表達同樣是膽囊癌患者不良預后(生存時間)的獨立危險因素，這可能與DILC促進膽囊癌細胞侵襲和遷移有關。本研究結果顯示，轉(zhuǎn)染組侵襲細胞數(shù)和細胞遷移距離均低于陰性對照組(P<0.001)，這也提示DILC在膽囊癌中的生物學機制目前尚未明了，可能通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路促進癌細胞侵襲[5]。

綜上所述，DILC在膽囊癌組織中高水平表達，并且與腫瘤分期和生存預后有關。DILC可以促進膽囊癌細胞侵襲和遷移，其對膽囊癌作用的機制需要未來進行深入探討。