鄭靜楠 董文淵 鐘歡 尹澤南 吳義遠(yuǎn)

(云南省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院，昆明，650051) (西南林業(yè)大學(xué))

筇竹(Qiongzhueatumidinoda)為地下莖復(fù)軸混生的小型竹種，被列為國家三級(jí)保護(hù)的珍稀瀕危竹種之一[1]，僅分布于中國的西南部分地區(qū)。筇竹具有極高的觀賞、工藝、營養(yǎng)、生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-4]。適宜筇竹生長的生態(tài)環(huán)境被長時(shí)間破壞，加劇了筇竹資源的衰退，其常規(guī)繁殖常采用扦插,繁殖系數(shù)較低,且易造成病毒的積累,而通過組培技術(shù)可在短期內(nèi)獲得大量健康苗木。對筇竹的組培技術(shù)進(jìn)行研究,為今后科學(xué)化、規(guī)模化培育筇竹林提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料為筇竹成熟種胚。

1.1 試劑及設(shè)備

自動(dòng)雙重純水機(jī)、冰箱、自動(dòng)高壓蒸汽滅菌(YAMATO，SQ810C)、體視鏡(Nikon，ECLIPSE E100)、顯微鏡(Feica，MDG33)、電子天平、超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰)、紫外燈車(上海躍進(jìn))、恒溫箱、培養(yǎng)皿等實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備。

試驗(yàn)試劑；植物生長調(diào)節(jié)劑為2，4-D、KT、6-BA、NAA、IBA；MS大量元素、MS微量元素、鐵鹽、MS有機(jī)物、升汞、瓊脂、酒精、次氯酸鈉。

1.2 研究方法

1.2.1 試管苗無菌體系的建立

將挑選后并去外稃的種子，置于超凈工作臺(tái)上，設(shè)計(jì)9種滅菌消毒的方法，進(jìn)行試驗(yàn)[5-8]。

方法1：體積分?jǐn)?shù)75%酒精(浸泡)10 min→無菌水沖洗5次→體積分?jǐn)?shù)0.1%升汞(8 min)→無菌水沖洗5次→吸干水分→接種。

方法2：體積分?jǐn)?shù)75%酒精(浸泡)10 min→無菌水沖洗5次→體積分?jǐn)?shù)0.1%升汞(15 min)→無菌水沖洗5次→吸干水分→接種。

方法3：體積分?jǐn)?shù)75%酒精(浸泡)10 min→無菌水沖洗5次→0.2 mL氯酸鈉(浸泡)15 min→無菌水沖洗5次→體積分?jǐn)?shù)0.1%升汞(8 min)→無菌水沖洗5次→吸干水分→接種。

方法4：體積分?jǐn)?shù)0.2%次氯酸鈉(2 h)→體積分?jǐn)?shù)75%酒精(15 min)→體積分?jǐn)?shù)0.1%升汞(8 min)。

方法5：體積分?jǐn)?shù)0.5%甲醛(2 h)→體積分?jǐn)?shù)75%酒精(15 min)→體積分?jǐn)?shù)0.1%升汞(8 min)。

方法6：體積分?jǐn)?shù)0.2%次氯酸鈉(12 h)→體積分?jǐn)?shù)75%酒精(15 min)→體積分?jǐn)?shù)0.1%升汞(8 min)。

方法7：體積分?jǐn)?shù)0.5%甲醛(12 h)→體積分?jǐn)?shù)75%酒精(15 min)→體積分?jǐn)?shù)0.1%升汞(8 min)。

方法8：體積分?jǐn)?shù)2.5%次氯酸鈉(2 h)→體積分?jǐn)?shù)75%酒精(15 min)→體積分?jǐn)?shù)0.1%升汞(8 min)。

方法9：體積分?jǐn)?shù)2.5%甲醛(2 h)→體積分?jǐn)?shù)75%酒精(15 min)→體積分?jǐn)?shù)0.1%升汞(8 min)。

種子消毒后，將種子置于接種盤上進(jìn)行解剖，選取筇竹種胚為外植體，接種于空白MS，pH值為5.6～5.8的培養(yǎng)基中，每種消毒方法接種于3組培養(yǎng)基中，每組設(shè)置15個(gè)組培瓶，每個(gè)組培瓶接種1顆種子，共45顆，培養(yǎng)條件為(25±1)℃、光照2 000 lx、光照時(shí)間12 h·d-1，觀察記錄各處理的種子在接種5、12、20 d的污染和萌發(fā)情況。

1.2.2 試管苗叢芽誘導(dǎo)

以筇竹種胚作為外植體，接入?yún)惭空T導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS，pH值5.6～5.8為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，生長調(diào)節(jié)劑選用6-BA1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg·L-15個(gè)質(zhì)量濃度水平和NAA0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-15個(gè)質(zhì)量濃度水平，自由組合(表1，表2)，為25個(gè)自由組合進(jìn)行試驗(yàn)，篩選適宜叢生芽誘導(dǎo)的生長調(diào)節(jié)劑種類及配比，每個(gè)處理接種45瓶，每瓶1個(gè)種胚，每個(gè)處理重復(fù)3次[9-15]。培養(yǎng)條件同上，30 d左右進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)叢芽誘導(dǎo)結(jié)果。

表1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑的叢生芽誘導(dǎo)

1.2.3 叢生芽增殖培養(yǎng)基篩選

為了使叢生芽得到大規(guī)模、快速繁殖，需要在原代培養(yǎng)叢生芽的基礎(chǔ)上進(jìn)行繼代增殖。由于各種植物生長調(diào)節(jié)劑之間可能存在相互作用，以MS培養(yǎng)基、6-BA質(zhì)量濃度、NAA質(zhì)量濃度、KT質(zhì)量濃度為4因素，每個(gè)因素3水平L9(34)進(jìn)行正交設(shè)計(jì)方案，探索更為準(zhǔn)確的叢生芽增殖配方[16-21]。設(shè)置9個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果，具體設(shè)計(jì)方案見表3和表4。取誘導(dǎo)出的長勢一致的無菌叢芽，接于提前配置好的培養(yǎng)基中，每瓶接1叢，每組25瓶，每個(gè)處理重復(fù)3次。

表2 誘導(dǎo)叢生芽的設(shè)計(jì)方案

表3 不同植物調(diào)節(jié)劑對叢芽增殖影響的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表4 叢芽增殖試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案L9(34)

1.2.4 生根誘導(dǎo)

以1/2MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度和配比的6-BA、NAA和IBA植物生長調(diào)節(jié)劑組合設(shè)計(jì)到培養(yǎng)基中。其中植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA質(zhì)量濃度分別為0.3、0.5、0.8 mg·L-1；NAA質(zhì)量濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg·L-1；IBA質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0 mg·L-1(表5)。通過3因素3水平正交設(shè)計(jì)L9(33)(表6)，每瓶接種一個(gè)筇竹苗叢，每個(gè)處理接種25瓶，重復(fù)3次，詳見表6。在前一階段的繼代培養(yǎng)中選取分化長2.0 cm以上的無根筇竹小苗，接種于表6的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，試圖找到最佳的生根壯苗試驗(yàn)配方[21-24]。

表5 不同植物調(diào)節(jié)劑生根誘導(dǎo)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表6 不同植物調(diào)節(jié)劑生根壯苗的正交設(shè)計(jì)方案

1.2.5 煉苗移栽

將組培瓶瓶蓋打開，置于常溫室內(nèi)自然散射光下進(jìn)行煉苗，煉苗3～5 d后，選擇挑選生長良好、根系完整的組培苗取出，洗凈根部附著的瓊脂，以腐殖土、珍珠巖和河沙為原料，配置3種不同的基質(zhì)(表7)，然后將組培苗從組培瓶中移栽到不同基質(zhì)中。30 d后觀測記錄成活率及生長情況，比較不同基質(zhì)對移栽成活率的影響。

表7 移栽基質(zhì)及其組成成分

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體無菌體系的建立

由于筇竹種子被稃葉包裹，胚位于果基部，消毒液不易浸入，加之稃葉易生長各種霉菌。在選用了3種組培常用的基本消毒方法基礎(chǔ)之上再設(shè)置了5種消毒方法處理，分別接種到MS空白培養(yǎng)基上，20 d后統(tǒng)計(jì)污染與成活率(表8)。

表8 不同處理對外植體消毒效果的影響

由表8可知，單一組織消毒方法的效果較組合消毒試劑浸泡處理后的效果差，消毒試劑浸泡后，污染率隨之降低。為了進(jìn)一步證明不同處理對筇竹外植體的影響，對污染率、萌芽率及成活率進(jìn)行分析，效果詳見表8。

從表8可以看出，隨著所使用消毒試劑種類、質(zhì)量濃度及浸泡時(shí)間的增加，材料污染率隨之降低，但萌芽率及成活率也受到了影響；用體積分?jǐn)?shù)0.2%的次氯酸鈉對種子進(jìn)行浸泡比直接用酒精浸泡效果好，原因是酒精對種胚有一定的刺激作用，產(chǎn)生傷害；用體積分?jǐn)?shù)0.2%次氯酸鈉和體積分?jǐn)?shù)0.2%甲醛浸泡比體積分?jǐn)?shù)2.5%次氯酸鈉和體積分?jǐn)?shù)0.2%甲醛浸泡效果好，研究發(fā)現(xiàn)，高體積分?jǐn)?shù)浸泡可使污染率降低，但萌芽率和成活率顯著下降；使用體積分?jǐn)?shù)0.2%次氯酸鈉和體積分?jǐn)?shù)0.5%甲醛浸泡12 h和浸泡2 h萌芽率和成活率差異不大，但浸泡12 h后污染率卻顯著降低；且使用體積分?jǐn)?shù)0.5%甲醛的萌芽率和成活率比體積分?jǐn)?shù)0.2%次氯酸鈉高，污染率低，對種胚的傷害也相對較小，整體效果好。

結(jié)果表明，單用酒精、次氯酸鈉、甲醛、升汞中的任何一種試劑的效果比組合使用消毒效果差。因此，滅菌消毒的方法7為最佳消毒方式，即采用體積分?jǐn)?shù)0.5%甲醛(12 h)→體積分?jǐn)?shù)75%酒精(15 min)→體積分?jǐn)?shù)0.1%升汞(8 min)的處理效果為理想，種胚污染率為3.33%，萌芽率為86.21%，成活率為83.33%。

2.2 不同生長調(diào)節(jié)劑對叢芽誘導(dǎo)的影響

筇竹叢芽經(jīng)過不同生長調(diào)節(jié)劑30 d的誘導(dǎo)，不同質(zhì)量濃度6-BA對筇竹萌芽率、叢芽誘導(dǎo)率有一定的影響(表9)，隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，種胚萌芽率呈下降趨勢，叢芽誘導(dǎo)率先增加后減少。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1時(shí)萌芽率、叢芽誘導(dǎo)率為最高。

由表10可知，不同質(zhì)量濃度6-BA對叢芽種胚叢芽誘導(dǎo)率影響差異顯著，對萌發(fā)率影響差異不顯著。

表9 不同質(zhì)量濃度6-BA對叢芽萌芽率和誘導(dǎo)率的影響

表10 不同質(zhì)量濃度6-BA對叢芽誘導(dǎo)的方差分析

表11 不同質(zhì)量濃度NAA對萌芽率、叢芽誘導(dǎo)率的影響

由表11、表12可以看出，不同質(zhì)量濃度的NAA對筇竹的萌芽率、叢芽誘導(dǎo)率的影響均差異不顯著，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為0.2 mg·L-1時(shí)的萌芽率、叢芽誘導(dǎo)率最高。由此得出，筇竹叢芽誘導(dǎo)率同時(shí)受到種胚的萌芽率和叢芽誘導(dǎo)率指標(biāo)的影響，基于叢芽誘導(dǎo)率考慮，可以將MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA看作較好的試驗(yàn)組合，該組合叢芽誘導(dǎo)率最高，為66.67%。

表12 不同質(zhì)量濃度NAA對筇竹叢芽誘導(dǎo)的方差分析

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對筇竹叢生芽增殖的影響

取長勢良好的筇竹試管叢生苗接入表4的不同處理的培養(yǎng)基中，30 d后記錄統(tǒng)計(jì)叢生芽增殖倍數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果見表13、表14。

由表13和表14可以看出，各水平之間差異略顯著。4個(gè)因素中，極差(R)值最大的是KT因素，最小的是NAA因素和6-BA因素，4個(gè)因素對筇竹叢生芽苗增殖倍數(shù)的影響由大到小的順序?yàn)镵T、培養(yǎng)基、NAA、6-BA。因此，隨著KT質(zhì)量濃度的逐漸增加，叢生芽的增殖倍數(shù)先減后增，當(dāng)KT質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1時(shí)增殖倍數(shù)達(dá)到最大，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，深入確定試驗(yàn)因子及其各水平對試驗(yàn)結(jié)果的影響程度(表15)。

表13 叢生芽增值倍數(shù)正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析

表14 叢生芽增值倍數(shù)正交試驗(yàn)結(jié)果K值優(yōu)水平

表15 筇竹叢芽增殖倍數(shù)正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

方差分析結(jié)果與極差分析結(jié)果趨勢一致，6-BA、NAA質(zhì)量濃度對分化叢芽的增殖影響極顯著。而KT質(zhì)量濃度對分化叢芽增殖的影響不顯著，說明6-BA和NAA具有很重要的作用。對觀測到的增殖情況和試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，研究認(rèn)為，適合筇竹分化叢芽增殖的培養(yǎng)基配方為1/2MS+0.3 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA。

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對再生植株誘導(dǎo)生根的影響

以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將誘導(dǎo)分化出的健康芽叢長成的小植株轉(zhuǎn)入表6的不同處理的生根培養(yǎng)基中，30 d后記錄統(tǒng)計(jì)平均生根率，并對生根率進(jìn)行直觀分析和方差分析(表16)。

由表16和表17可知，試驗(yàn)3個(gè)因素中R值最大的是NAA因素，最小的是6-BA因素，3個(gè)因素對筇竹生根率的影響由大到小的順序?yàn)镹AA、IBA、6-BA，因此，NAA質(zhì)量濃度對生根率的影響最大。

表16 植物生長調(diào)節(jié)劑生根試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)

表17 植物生長調(diào)節(jié)劑生根正交試驗(yàn)結(jié)果K值優(yōu)水平

誘導(dǎo)叢生芽生根在竹類植物組培快繁中占據(jù)重要地位，是其試管快繁成功的關(guān)鍵。在誘導(dǎo)生根的過程中，培養(yǎng)基內(nèi)僅添加一種植物生長調(diào)節(jié)劑易使叢生芽發(fā)生褐化甚至死亡，且生根率不高，植株長勢不良，配合其他細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基在褐化、生根率及植株長勢上均有明顯提高，究其原因可能是細(xì)胞分裂素抑制了葉綠素的降解，對竹類植物的葉片保持活力，且細(xì)胞分裂素對氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸有一定作用，進(jìn)而延緩植物組織的老化。所以在誘導(dǎo)生根的過程中，將植物生長素與細(xì)胞分裂素的配合使用顯得尤為重要。從筇竹組培苗長勢、煉苗與移栽后的效果，結(jié)合生根率、生根數(shù)和根系質(zhì)量綜合分析，確定出筇竹組培苗最優(yōu)培養(yǎng)基為1/2MS+0.3 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-1IBA。

2.5 不同基質(zhì)對筇竹組培苗移栽成活率的影響

煉苗移栽30 d，在m(河沙)∶m(腐殖土)=1∶2的基質(zhì)中成活率為40%，筇竹移栽苗生長緩慢，部分頂端葉片發(fā)黃；在m(珍珠巖)∶m(腐殖土)=1∶2的基質(zhì)中成活率為60%，筇竹移栽苗長勢良好，葉片深綠色；在m(河沙)∶m(珍珠巖)∶m(腐殖土)=1∶1∶2的基質(zhì)中成活率達(dá)到90%，且苗生長健康茂盛，葉片深綠色(表18)。由此可以看出，筇竹移植苗在m(河沙)∶m(珍珠巖)∶m(腐殖土)=1∶1∶2的成活率最高，且苗生長狀況最佳，在規(guī)?；M(jìn)行移栽時(shí)，應(yīng)選用m(河沙)∶m(珍珠巖)∶m(腐殖土)=1∶1∶2的基質(zhì)進(jìn)行移植。

表18 不同基質(zhì)對筇竹組培苗移栽成活率的影響

3 結(jié)論與討論

筇竹外植體單一組織消毒方法的效果較組合消毒試劑浸泡處理后的效果差，不同消毒試劑種類、質(zhì)量濃度及浸泡時(shí)間長短對其萌芽率和成活率具有直接的影響。研究結(jié)果表明，單用酒精、次氯酸鈉、甲醛、升汞中的任何一種試劑對筇竹外植體消毒的效果比組合使用消毒效果差，采用體積分?jǐn)?shù)0.5%甲醛(12 h)→體積分?jǐn)?shù)75%酒精(15 min)→體積分?jǐn)?shù)0.1%升汞(8 min)的處理效果最為理想，種胚污染率為3.33%，萌芽率為86.21%，成活率為83.33%。

在不同生長調(diào)節(jié)劑對筇竹叢芽誘導(dǎo)的影響方面，不同質(zhì)量濃度的NAA對筇竹的萌芽率、叢芽誘導(dǎo)率的影響均差異不顯著。研究表明，只有當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為0.2 mg·L-1時(shí)的萌芽率、叢芽誘導(dǎo)率最高，即MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA的試驗(yàn)組合筇竹叢芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)到66.67%。

筇竹叢生芽增殖的影響在不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的影響下，KT質(zhì)量濃度是筇竹叢生芽增殖倍數(shù)的決定性影響因子，隨著KT質(zhì)量濃度的逐漸增加，叢生芽的增殖倍數(shù)先減后增，當(dāng)KT質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1時(shí)增殖倍數(shù)達(dá)到最大。研究表明，6-BA、NAA質(zhì)量濃度對分化叢芽的增殖影響極顯著，最適合筇竹分化叢芽增殖的培養(yǎng)基配方為1/2MS+0.3 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA。

在利用不同植物生長調(diào)節(jié)劑對筇竹誘導(dǎo)生根的過程中，培養(yǎng)基內(nèi)僅添加一種植物生長調(diào)節(jié)劑易使叢生芽發(fā)生褐化甚至死亡，且生根率不高，植株長勢不良，配合其他細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基在褐化、生根率及植株長勢上均有明顯提高，研究認(rèn)為，由于細(xì)胞分裂素抑制了葉綠素的降解，同時(shí)細(xì)胞分裂素促進(jìn)氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，進(jìn)而延緩筇竹組織的老化。在筇竹組培苗生長、煉苗與移栽后進(jìn)行觀察試驗(yàn)，確定最優(yōu)培養(yǎng)基為1/2MS+0.3 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-1IBA。另外，筇竹移植苗在m(河沙)∶m(珍珠巖)∶m(腐殖土)=1∶1∶2基質(zhì)中的成活率最高，且苗生長狀況最佳，可以應(yīng)用于規(guī)?；M(jìn)行移栽。

由于筇竹離體快繁中種胚需要在無菌的條件下進(jìn)行組培，生產(chǎn)環(huán)境要求較高；不同的消毒組合對筇竹種胚的污染率、萌芽率和成活率有不同程度的影響，本研究設(shè)置9種消毒組合方式有一定的局限性，消毒的組合方式有待進(jìn)一步探究；試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)采用的KT質(zhì)量濃度跨度不夠明顯，還需進(jìn)一步設(shè)置大梯度KT質(zhì)量濃度對生根培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。