于丹 劉肖娟 畢泉鑫 趙陽 句嬌 于海燕 王利兵

(國家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所)，北京，100091)

杏(PrunusarmeniacaLinn.)，薔薇科(Rosaceae)杏屬(Armeniaca)，具有耐干旱、耐瘠薄、冬季耐低溫、抗鹽堿等特性，其分布范圍較廣，主要集中在華北、華東以及西北等地區(qū)，是我國北方地區(qū)重要的栽培樹種之一[1-2]。杏樹具有巨大的開發(fā)價值，杏果和杏仁中含有豐富的維生素、礦質(zhì)元素和胡蘿卜素等，具有止咳平喘、預(yù)防和治療癌癥等功效[1-3]，杏仁油富含油酸(63.39%)和亞油酸(28.79%)，不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的90%以上，是一種優(yōu)質(zhì)食用油[4-6]；杏木可作家具和工藝品；杏殼是制作活性炭的原料。但是，晚霜危害在西北地區(qū)普遍存在，而且由于杏樹開花時間較早，其花、芽等生殖器官極易受到晚霜的危害，嚴(yán)重影響其生長發(fā)育及產(chǎn)量，晚霜已成為限制杏樹生產(chǎn)和發(fā)展的重要環(huán)境因素[3，7]。因此，明確杏樹花期的抗寒機(jī)理、選育抗凍品種對杏樹的發(fā)展有重要意義。

杏樹花期的抗寒性與細(xì)胞膜的損傷程度、抗氧化酶活性以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等密切相關(guān)[8-10]。然而，有關(guān)杏樹雌蕊對低溫脅迫和恢復(fù)后的響應(yīng)的比較研究較少，而且關(guān)于雌蕊的可承受的極限溫度以及雌蕊的解剖結(jié)構(gòu)的研究也較少。文中通過對抗寒品種‘圍選1號’和冷敏感品種‘龍王帽’雌蕊的表型、解剖結(jié)構(gòu)以及生理指標(biāo)的觀測，探究杏樹花期對低溫脅迫及恢復(fù)過程的響應(yīng)，為杏樹花期晚霜響應(yīng)機(jī)理的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來自陜西省榆林市李杏優(yōu)良品種種質(zhì)資源圃。隨機(jī)采取抗寒性不同的2個杏樹品種‘圍選1號’和‘龍王帽’東、南、西、北方向的1年生枝條各30枝，混合并帶回溫室水培。試驗(yàn)采用單株小區(qū)，重復(fù)3次。

1.2 低溫處理

將杏樹花枝在溫室(20 ℃)水培至盛花期，將枝條分批放入LED人工氣候箱中，試驗(yàn)溫度設(shè)置為0、-2、-4、-6、-8 ℃共5個溫度。以0.5 h降溫10 ℃的速度從20 ℃降至2 ℃，再以3 ℃·h-1的降溫速度降至所需溫度并在所需溫度處維持1 h，并將枝條放在室溫下恢復(fù)3 h。隨機(jī)采取盛花期的雌蕊用于相對電導(dǎo)率的測定，并利用Logistic方程計算出杏樹雌蕊的低溫半致死溫度(LT50)。

根據(jù)上述計算的‘圍選1號’和‘龍王帽’雌蕊的LT50設(shè)置杏樹枝條處理的溫度梯度為-1、-2、-3、-4、-6 ℃，降溫速度與上述一致。低溫處理完成后，將試驗(yàn)材料分為2批，一批直接在低溫環(huán)境下采樣后分別放入FAA固定液(體積分?jǐn)?shù)38%甲醛+醋酸+體積分?jǐn)?shù)70%酒精)和液氮中，用于解剖結(jié)構(gòu)和生理指標(biāo)的觀測；另一批在室溫恢復(fù)3 h后再取樣并分別放入FAA固定液和液氮中，用于褐化率的統(tǒng)計和生理指標(biāo)的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 相對電導(dǎo)率的測定

稱取0.1 g新鮮雌蕊放入裝有10 mL去離子水的試管中，將試管放入真空干燥器中，反復(fù)抽氣4次，每次20 min，測定其初始電導(dǎo)，然后將其置入沸水中水浴30 min，冷卻至室溫后測其最終電導(dǎo)。計算相對電導(dǎo)率。相對電導(dǎo)率=(初始電導(dǎo)-去離子水電導(dǎo))/(最終電導(dǎo)-去離子水電導(dǎo))。

將杏樹雌蕊的相對電導(dǎo)率擬合成Logistic方程：

Y=K/(1+ae-bx)。

式中：Y為相對電導(dǎo)率；K為極限相對電導(dǎo)率；a，b均為方程參數(shù)；x為溫度。

求Logistic方程的二階導(dǎo)數(shù)，并令其為0，可得到方程的拐點(diǎn)溫度LT50。

LT50=(lna)/b。

1.3.2 雌蕊表型及褐化率的觀測

組織褐變是植物受到凍害最直接的形態(tài)表現(xiàn)[11-12]。低溫脅迫后，在室溫下靜置3 h后，隨機(jī)選取100個雌蕊，觀察其褐變程度并計算其褐化率，重復(fù)3次。

1.3.3 解剖結(jié)構(gòu)的觀察

采用常規(guī)石蠟切片法[13]。將FAA固定液中的雌蕊依次進(jìn)行一系列濃度的酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，連續(xù)切片，粘片，番紅-固綠染色，封片。切片厚度為10 μm。

1.3.4 生理指標(biāo)的測定

丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性測定分別采用巴比妥酸法、過氧化氫法和愈創(chuàng)木酚法[14-15]。MDA質(zhì)量摩爾濃度，CAT和POD活性的測定所用的試劑盒均由中國北京索萊寶科技有限公司提供。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 21.00對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析以及Duncan多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下杏樹品種雌蕊相對電導(dǎo)率的變化以及LT50的確定

2個杏樹品種雌蕊相對電導(dǎo)率的變化如表1所示。隨著溫度的降低‘龍王帽’和‘圍選1號’的相對電導(dǎo)率均呈現(xiàn)不斷升高的趨勢?！埻趺薄汀畤x1號’相對電導(dǎo)率的增長速率有所差異。‘龍王帽’相對電導(dǎo)率在0～-2、-2～-4、-4～-6、-6～-8 ℃的增長分別為1100%、117%、10%和33%，其中，在-4～-8 ℃時相對電導(dǎo)率有輕微升高直至趨于平緩；‘圍選1號’的相對電導(dǎo)率在0～-2、-2～-4、-4～-6、-6～-8 ℃的增長分別為992%、63%、52%和12%，其中，相對電導(dǎo)率在-6～-8 ℃趨于平緩。另外，在相同脅迫條件下，‘圍選1號’的相對電導(dǎo)率始終低于‘龍王帽’。

表1 低溫脅迫下杏樹相對電導(dǎo)率的變化

利用Logistic方程對‘龍王帽’和‘圍選1號’的相對電導(dǎo)率進(jìn)行擬合。由表2可知，‘龍王帽’和‘圍選1號’的擬合度R2分別為0.999和0.984，均達(dá)到顯著水平，表明擬合結(jié)果可靠、精確度高。‘龍王帽’和‘圍選1號’的LT50分別為-2.30 ℃和-3.44 ℃，表明相較于‘龍王帽’，‘圍選1號’雌蕊的抗寒性更強(qiáng)。

表2 杏樹雌蕊的Logistic方程以及低溫半致死溫度的確定

2.2 低溫脅迫和恢復(fù)處理對杏樹雌蕊表型及解剖結(jié)構(gòu)的影響

在凍害下，植物組織解凍后會釋放一些酚類化合物，導(dǎo)致受損組織變成褐色[11]，因此，杏樹雌蕊在室溫恢復(fù)3 h后對其褐化率進(jìn)行了觀測。隨溫度的降低‘龍王帽’和‘圍選1號’的褐變程度加劇，褐化率也呈逐漸上升的趨勢(圖1，表3)。在-1 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊均未發(fā)生明顯的變化，表明雌蕊未受到凍害。在-2～-4 ℃時，‘龍王帽’的褐化率始終高于‘圍選1號’，其中，-3 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’的褐化率急劇升高，分別是-2 ℃時的1.94倍和3.50倍。在-6 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊的褐化率均達(dá)到100%。

圖1 低溫脅迫下杏樹雌蕊的表型變化

表3 低溫脅迫下杏樹雌蕊的褐化率

采用常規(guī)石蠟切片法，對‘龍王帽’和‘圍選1號’的雌蕊的連續(xù)切片進(jìn)行觀察(圖2)。在低溫脅迫下，‘龍王帽’雌蕊在20、-1 ℃和-2 ℃均未發(fā)現(xiàn)明顯變化，在-3 ℃時，‘龍王帽’雌蕊的子房壁出現(xiàn)小裂隙或空腔，-4 ℃和-6 ℃時，其子房壁和胚珠均出現(xiàn)較大裂隙和空腔；‘圍選1號’雌蕊在20、-1、-2 ℃和-3 ℃均未發(fā)現(xiàn)明顯變化，在-4 ℃和-6 ℃時子房壁和胚珠均出現(xiàn)裂隙和空腔。在恢復(fù)過程中，‘龍王帽’在-3 ℃的子房壁有小空腔，在-4 ℃和-6 ℃的子房壁、胚珠均出現(xiàn)較大裂隙；‘圍選1號’的子房壁和胚珠在-4 ℃出現(xiàn)輕微裂隙，在-6 ℃時子房壁和胚珠均出現(xiàn)較大的裂隙和空腔。另外，在-4 ℃時，低溫脅迫和恢復(fù)過程中‘圍選1號’的裂隙總是比‘龍王帽’小。

圖2 低溫脅迫和恢復(fù)處理對杏樹雌蕊解剖結(jié)構(gòu)的影響

2.3 低溫脅迫和恢復(fù)處理對2個杏樹品種雌蕊生理指標(biāo)的影響

2.3.1 對杏花雌蕊MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響

低溫脅迫和恢復(fù)處理過程中的MDA質(zhì)量摩爾濃度變化如表4所示。‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊中的MDA質(zhì)量摩爾濃度均隨溫度的降低呈上升的趨勢，其中，-6 ℃時‘龍王帽’和‘圍選1號’的MDA質(zhì)量摩爾濃度與對照組(20 ℃)的差異極顯著。同一低溫脅迫下‘龍王帽’的MDA質(zhì)量摩爾濃度始終高于‘圍選1號’，而且隨著溫度的降低兩者M(jìn)DA質(zhì)量摩爾濃度的差距越來越大?！埻趺薄疢DA質(zhì)量摩爾濃度在-2～-6 ℃的增長幅度較大，而‘圍選1號’MDA質(zhì)量摩爾濃度在-3～-6 ℃的增長幅度較大。

在低溫脅迫下，-6 ℃時‘龍王帽’和‘圍選1號’的MDA質(zhì)量摩爾濃度分別為43.77、29.42 nmol·g-1，分別是對照組(20 ℃)的2.28倍和1.43倍。在恢復(fù)處理下，-6 ℃時‘龍王帽’和‘圍選1號’MDA質(zhì)量摩爾濃度分別為38.75、26.16 nmol·g-1，分別是對照組(20 ℃)的1.90倍和1.16倍。在低溫脅迫和恢復(fù)處理下，‘龍王帽’MDA質(zhì)量摩爾濃度在-3～-6 ℃時極顯著高于‘圍選1號’。另外，相較于低溫脅迫，‘龍王帽’和‘圍選1號’恢復(fù)處理過程中的MDA質(zhì)量摩爾濃度均有所降低(表4)。

2.3.2 對杏花雌蕊抗氧化酶活性的影響

不同低溫脅迫下，杏樹雌蕊抗氧化酶活性(POD和CAT)變化如表4所示?！埻趺薄汀畤x1號’雌蕊的POD和CAT活性隨溫度的降低呈‘上升-下降’的趨勢，二者POD和CAT活性均在-3 ℃達(dá)到最大值，而且在同一溫度下‘龍王帽’的POD和CAT活性均低于‘圍選1號’的；低溫脅迫時的POD和CAT活性總是低于恢復(fù)過程中的酶活性。

POD是植物應(yīng)對脅迫時的重要抗氧化酶[16]。以低溫脅迫過程為例，-1～-6 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’的POD活性與對照組差異極顯著。其中，在-3 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊的POD活性達(dá)到最大值，分別為491.27、606.18 U·g-1，分別是對照組的1.73倍和2.89倍；此外，在-3～-4 ℃時，‘圍選1號’的POD活性極顯著高于‘龍王帽’；在-6 ℃時，‘圍選1號’的POD活性顯著高于‘龍王帽’(表4)。

CAT對H2O2的清除有重要作用[17]。以低溫脅迫過程為例，在-1～-6 ℃，‘龍王帽’和‘圍選1號’的CAT活性極顯著高于對照組。其中，-3 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊的CAT活性分別為441.21、480.72 U·g-1，分別是對照組的2.43倍和2.27倍；此外，在-3 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’的CAT活性并無顯著差異，但在-4～-6 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’的CAT活性差異極顯著(表4)。

表4 低溫脅迫和恢復(fù)過程中杏樹雌蕊生理指標(biāo)變化

品種處理POD活性/U·g-120℃-1℃-2℃-3℃-4℃-6℃‘圍選1號’低溫(156.00±31.00)K(307.64±48.70)GHIJ(483.08±48.78)CD(606.18±25.48)AB(554.17±28.44)BC(346.73±32.14)FGHI恢復(fù)(156.00±31.00)K(376.01±47.64)EFGH(532.21±35.42)BC(684.01±33.15)A(612.09±38.11)AB(382.11±46.14)EFG‘龍王帽’低溫(179.86±17.56)K(239.94±15.84)J(424.55±27.60)DEF(491.27±47.77)CD(391.17±18.07)EFG(273.91±38.38)IJ恢復(fù)(179.86±17.56)K(293.97±26.21)HIJ(506.07±38.03)CD(545.00±32.25)BC(442.18±35.46)DE(309.17±39.95)GHIJ

品種處理CAT活性/U·g-120℃-1℃-2℃-3℃-4℃-6℃‘圍選1號’低溫(147.10±14.14)MN(240.34±30.03)KL(370.67±44.67)EFGH(480.72±46.10)ABC(451.92±30.17)BCD (290.93±33.61)IJK恢復(fù)(147.10±14.14)MN(285.20±27.42)IJK(432.18±33.11)CDEF(551.68±40.26)A(511.71±25.82)AB(322.58±22.01)HIJ‘龍王帽’低溫(128.50±28.07)N(205.31±32.23)LM(359.75±38.22)FGHI(441.21±35.22)BCDE(345.73±24.10)GHI(204.54±31.78)LM恢復(fù)(128.50±28.07)N(250.34±29.30)JKL(418.13±24.48)CDEFG(491.01±28.23)ABC(391.87±30.75)DEFGH(233.50±38.01)KL

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以2個抗寒性不同的杏樹品種‘龍王帽’和‘圍選1號’的雌蕊[7，18]為試驗(yàn)材料，利用LED人工氣候箱模擬自然降溫過程，重點(diǎn)對低溫脅迫和恢復(fù)處理過程中杏花雌蕊的表型、解剖結(jié)構(gòu)和生理指標(biāo)進(jìn)行了觀測。研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低，‘龍王帽’和‘圍選1號’的褐變程度加劇且褐化率增加，但-2～-4 ℃時，‘圍選1號’的褐化率始終低于‘龍王帽’。該結(jié)果與王萍等[7]的研究結(jié)果一致。在-6 ℃時，‘圍選1號’和‘龍王帽’雌蕊的褐化率均達(dá)到100%，表明此時2個杏樹品種的雌蕊均受到嚴(yán)重的凍害。

凍害會引起細(xì)胞間隙的水結(jié)冰，導(dǎo)致原生質(zhì)脫水，破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；隨后，原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)也會因凍害而結(jié)冰，造成不可逆損傷[3]。本研究中，‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊因凍害產(chǎn)生了一些空腔或裂隙，推測這些空腔或裂隙可能是因細(xì)胞失水或死亡導(dǎo)致的；另外，‘龍王帽’在-3 ℃發(fā)現(xiàn)裂隙，而‘圍選1號’在-4 ℃發(fā)現(xiàn)裂隙，相對于‘圍選1號’，‘龍王帽’裂隙出現(xiàn)的溫度較高，且裂隙較多或較大，這表明相同條件下‘龍王帽’的雌蕊細(xì)胞被凍害破壞較嚴(yán)重。彭偉秀等[19]在研究低溫脅迫對杏樹子房結(jié)構(gòu)的影響中發(fā)現(xiàn)，在-3 ℃時，‘優(yōu)一’和‘一窩蜂’的子房均出現(xiàn)一些裂隙或空腔，這與本研究結(jié)果相似。

當(dāng)植物受到凍害時，細(xì)胞膜透性變大，導(dǎo)致電解質(zhì)外滲，而且植物的相對電導(dǎo)率與植物的抗寒性呈負(fù)相關(guān)[20-21]。隨著溫度的降低，‘龍王帽’和‘圍選1號’的相對電導(dǎo)率均不斷升高，這表明細(xì)胞膜的損傷程度隨溫度的降低而加劇?！埻趺薄汀畤x1號’雌蕊的相對電導(dǎo)率分別在-2 ℃時增長速率最大，分別是對照組(20 ℃)的11.00倍和9.92倍，說明‘龍王帽’和‘圍選1號’的膜系統(tǒng)分別在0～-2 ℃受到嚴(yán)重的低溫傷害，但‘圍選1號’細(xì)胞膜透性受到的傷害較小。-4～-8 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’增長速率逐漸降低，表明杏樹雌蕊細(xì)胞膜透性逐漸變大，電解質(zhì)外滲嚴(yán)重?！埻趺薄汀畤x1號’雌蕊分別在-4～-8 ℃和-6～-8 ℃時相對電導(dǎo)率變化趨于平緩且均為82%以上，表明此時‘龍王帽’和‘圍選1號’的細(xì)胞膜透性基本已被完全破壞，細(xì)胞死亡。LT50可反映植物可承受的極限低溫，LT50越低其抗寒性越強(qiáng)[22]?！畤x1號’的LT50低于‘龍王帽’，表明‘圍選1號’可承受的極限溫度較低，抗寒性更強(qiáng)。低溫脅迫下，植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧和自由基，導(dǎo)致膜脂過氧化并積累大量MDA，所以MDA質(zhì)量摩爾濃度反映了細(xì)胞膜損傷的程度[23-25]。本研究中，‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊的MDA質(zhì)量摩爾濃度呈逐漸上升的趨勢，-6 ℃時，MDA質(zhì)量摩爾濃度極顯著高于對照組(20 ℃)?！埻趺薄迫锏腗DA質(zhì)量摩爾濃度始終高于‘圍選1號’，表明‘圍選1號’細(xì)胞膜損傷的程度較?。弧埻趺薄汀畤x1號’在恢復(fù)處理過程中的MDA質(zhì)量摩爾濃度相較于低溫脅迫過程中均有所降低，這表明恢復(fù)室溫后其膜系統(tǒng)的損傷也有所緩解。

POD和CAT是植物體內(nèi)清除活性氧和自由基的重要抗氧化酶[26-28]。隨著脅迫的加劇，‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊的POD和CAT活性呈‘上升-下降’的趨勢。這與孟慶瑞等[29]的研究一致。其在-3 ℃達(dá)到最大值，這表明‘龍王帽’和‘圍選1號’的抗氧化能力在-3 ℃時最強(qiáng)；在-3 ℃之后，二者的酶活性均有不同程度的降低。相較于低溫脅迫，恢復(fù)處理時POD和CAT活性總是較高，這表明在溫度恢復(fù)后，植物會產(chǎn)生更多的抗氧化酶盡快清除體內(nèi)的自由基和活性氧；而在-6 ℃時，低溫脅迫和恢復(fù)處理中的酶活性相差較小，這表明杏樹雌蕊的抗氧化酶系統(tǒng)已遭受到嚴(yán)重的破壞。此外，同一溫度下‘龍王帽’的POD和CAT活性均低于‘圍選1號’，表明‘圍選1號’具有較強(qiáng)的抗氧化能力。總之，相較于‘龍王帽’，‘圍選1號’具有較強(qiáng)的抗氧化能力且恢復(fù)能力較強(qiáng)，這為解析杏樹雌蕊的霜凍響應(yīng)機(jī)理提供一定的基礎(chǔ)。