黃俊文 喬潔 梅子 陳茁 李楊 喬彬

1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科 鄭州450052；2.湖北大學生命科學學院 省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室 武漢430062

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcino?ma，OSCC）為常見腫瘤之一，其中每年新發(fā)病例約35.5 萬例，死亡病例約17.7 萬例[1]。近年來，有關(guān)OSCC 的診治取得很大進展。盡管如此，國外流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2019 年OSCC 的發(fā)病率和死亡率依舊達到3.71%和2.41%[2]。究其原因，除了有限的治療手段等因素外，腫瘤微環(huán)境與癌癥細胞間的相互作用在OSCC 的發(fā)生發(fā)展以及不良預后中扮演著重要角色。炎癥是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，與人類20%的腫瘤有關(guān)[3]，被認為是惡性腫瘤八大特征之一[4]。

脂多糖結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）是1 種主要由肝細胞合成的相對分子質(zhì)量為6×104的Ⅰ型急性期反應(yīng)糖蛋白[5]。LBP在調(diào)節(jié)感染或炎癥疾病引起的全身炎癥反應(yīng)中起到重要作用[6]，其對宿主免疫調(diào)節(jié)的作用主要是通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）介導的信號通路實現(xiàn)的。即LBP 參與LPS 向分化抗原簇14（cluster of differentiation 14，CD14）的轉(zhuǎn)移，然后 通 過Toll 樣 受 體4 （Toll?like receptor，TLR4）信號途徑激活巨噬細胞，從而引發(fā)先天性免疫反應(yīng)[7?8]。另有研究報道，LBP 在人外周血單核細胞上表達，并且還可以不依賴LPS 誘導途徑直接與人巨噬細胞和單核細胞相互作用[9]。此外，Boylan等[10]通過iTRAQ?定量蛋白質(zhì)組分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，人卵巢癌中LBP 蛋白表達量是正常人LBP 蛋白表達量的2 倍左右。隨后發(fā)現(xiàn)LBP 在多種癌組織中過表達，并且與癌癥的發(fā)展息息相關(guān)[11?13]。然而，LBP在OSCC中的作用卻鮮有研究。

CD204 亦稱巨噬細胞清道夫受體A（macroph?age scavenger receptor A，MSR?A），是巨噬細胞表達的主要受體之一[14]，主要調(diào)控巨噬細胞替代性活化。并且大量研究表明，CD204 與包括OSCC在內(nèi)的多種癌癥關(guān)系密切[15?18]。鑒于此，將LBP與CD204 進行免疫組織化學雙染實驗，可以初步探索LBP 與巨噬細胞的基本關(guān)系并為以后研究LBP與OSCC的作用機制奠定基礎(chǔ)。

本研究中，筆者通過對LBP、CD204 蛋白進行免疫組織化學雙染實驗以及酶聯(lián)免疫吸附試驗以檢測LBP 在OSCC 患者癌組織和血清中的表達情況。同時，本研究也對LBP 與OSCC 的臨床病理特征作了相關(guān)性分析，以探究LBP 在OSCC 中的表達及其潛在的意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象

本研究選擇2018 年1 月—2020 年4 月在鄭州大學第一附屬醫(yī)院診治的178名成年OSCC患者和90 名正常人。OSCC 患者納入標準為臨床病理診斷為原發(fā)性O(shè)SCC，并且術(shù)前未行放療和化療。其中選取48 名OSCC 患者，于手術(shù)過程中采集癌組織及相對應(yīng)癌旁組織（距離癌組織＞3 cm）標本，立即行4%多聚甲醛固定；選取130 名OSCC患者和90 名正常人分別于術(shù)前空腹及空腹狀態(tài)下抽取3 mL 外周靜脈血，注入促凝管中靜置1 h 后，4 ℃離心10 min（3 000 r·min?1），吸取血清并分裝置于?80 ℃中保存。收集患者的臨床病理資料主要包括腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和病理分級等。所有標本的收集及使用均經(jīng)受試者同意并簽署知情同意書，本實驗已經(jīng)鄭州大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準同意。

1.2 實驗材料

DS?0001 免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋公司），DY870?05 試劑盒（R&D Systems 中國公司）。兔抗人LBP 抗體（HPA001508，中國Sigma?Aldrich公司），工作質(zhì)量分數(shù)為1∶100；鼠抗人CD204 抗體（Clone No. SRA?E5，Transgenic公司，美國），工作質(zhì)量分數(shù)為1∶200。

1.3 免疫組織化學實驗

免疫組織化學實驗的主要步驟如下：厚度為3 μm 的組織切片分別經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟和水化，高溫高壓下檸檬酸鈉緩沖液抗原修復后進行內(nèi)源性酶阻斷劑和山羊血清封閉，LBP 和CD204 混合一抗4 ℃孵育過夜，復溫后行混合二抗孵育，DAB 和GBI 顯色，Mayer’s 蘇木素復染，封片等。未添加一抗組設(shè)為陰性對照組。每次實驗至少重復3次。所有切片均經(jīng)400倍放大觀察并選取10個具有代表性的視野進行拍片，由3名病理醫(yī)生結(jié)合巨噬細胞陽性染色的強度和所占百分比進行評分。巨噬細胞陽性染色強度記分的標準如下。0：無染色；1：輕度染色；2：中度染色；3：重度染色。陽性細胞所占百分比記分的標準如下。0：陰性；1：1%～25%陽性細胞；2：25%～50%陽性細胞；3：50%～75%陽性細胞；4：75%～100%陽性細胞。最后計算兩種記分的乘積求得平均值[19]。此平均值＞0者為陽性，反之為陰性。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗

血清樣本稀釋度為1∶100，實驗步驟嚴格按照DY870?05 試劑盒說明書進行，其主要步驟如下。首先將捕獲抗體包被在酶標板上，室溫孵育過夜，次日封閉液封閉1 h，隨后依次加入標準品或血清樣本及檢測抗體各室溫孵育2 h，接著先后加入辣根過氧化物標記酶和底物溶液顯色，各室溫避光孵育15 min，最后加入終止溶液終止顯色，用酶標儀分別在450 nm 和540 nm（校正波長）下測定光密度值（optical density，OD），進而繪制標準曲線計算樣本的LBP 血清質(zhì)量濃度。每次實驗至少重復3次。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21 進行數(shù)據(jù)分析，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布者用χˉ±SD 表示，選擇獨立樣本t檢驗或單因素ANOVA 分析比較LBP 或CD204 表達水平與不同分組之間的關(guān)系，反之用M（Q1?Q3）表示，選擇Mann?Whitney或Kruskal?Wallis非參數(shù)檢驗進行比較。采用Medcalc 繪制ROC 曲線分析LBP 血清濃度在OSCC 診斷的應(yīng)用價值，利用You?den 指數(shù)確定LBP 血清質(zhì)量濃度最佳臨界值并計算相應(yīng)的特異性和靈敏度。ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）采用Z檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LBP在OSCC組織中過表達

免疫組織化學實驗的標本信息見表1。LBP主要表達在OSCC 中的間質(zhì)細胞胞漿內(nèi)或胞膜上，呈紅色染色；CD204 主要表達在OSCC 中的巨噬細胞胞漿內(nèi)或胞膜上，呈黃褐色染色。CD204 和LBP 共表達在巨噬細胞中則呈現(xiàn)暗紅色染色，說明LBP 表達在巨噬細胞中。雙染結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和癌旁組織相比，OSCC 組織中的LBP 表現(xiàn)出更強的染色強度和更廣的染色范圍。本實驗對雙染結(jié)果進行半定量分析，發(fā)現(xiàn)癌組織中的免疫組織化學評分明顯比癌旁組織的高（P＜0.001），提示LBP可能是OSCC 的檢測標志物。同時CD204 在OSCC 組織中過表達（圖1）。另外，本實驗還發(fā)現(xiàn)，LBP 主要表達在巨噬細胞中，這提示LBP 可能通過與巨噬細胞相互作用從而對OSCC 產(chǎn)生影響。

表1 LBP的表達與OSCC患者臨床病理特點的關(guān)系Tab 1 Association between the patient’s clinicopathological characteristics and LBP expression in OSCC patients

2.2 LBP 與OSCC 患者的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期相關(guān)

本實驗對OSCC 的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期和臨床分期進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)在不同腫瘤分期的癌組織中，LBP 表達水平有明顯差異（P=0.007）。同時，臨床分期越高，LBP 表達量也越大（P=0.007）（圖2）。

與淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者的LBP 表達水平相比，淋巴結(jié)已轉(zhuǎn)移患者的LBP 表達水平顯著升高（P=0.039）（圖3）。

此外，本實驗也發(fā)現(xiàn)CD204 與OSCC 患者的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期明顯關(guān)聯(lián)（P＜0.05）。然而，本實驗并未發(fā)現(xiàn)LBP 或CD204 與OSCC 的病理分級有關(guān)（P＞0.05），其與患者的年齡、性別亦不相關(guān)（圖3）。

圖1 LBP和CD204在OSCC組織中過表達Fig 1 The overregulated expression of the LBP and CD204 protein in the OSCC tissues

圖2 LBP和CD204在不同的腫瘤分期以及臨床分期OSCC中的表達Fig 2 The LBP and CD204 protein expression in different T?classification and clinical stage of OSCC

圖3 LBP和CD204在不同的病理分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移OSCC中的表達Fig 3 The LBP and CD204 protein expression in different histological grade and node lymph metastasis of OSCC

從這些結(jié)果可以預測，LBP 與OSCC 的發(fā)生發(fā)展以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

2.3 LBP在OSCC患者血清中的表達

由于前期研究發(fā)現(xiàn)，LBP 與OSCC 有相關(guān)性，本研究則進一步檢測了LBP 在OSCC 患者血清中的表達情況。

酶聯(lián)免疫吸附試驗的標本信息見表2。實驗結(jié)果表明，正常人LBP 血清質(zhì)量濃度為1.02 μg·mL?1（0.81～1.10 μg·mL?1），OSCC 患者的LBP 血清質(zhì)量濃度為1.59 μg·mL?1（1.31～2.03 μg·mL?1）。與正常人比較，OSCC患者的LBP血清質(zhì)量濃度明顯升高（P＜0.001）。并且本實驗對OSCC 患者的臨床病理特點進行統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)LBP 血清質(zhì)量濃度與其臨床分期（P＜0.001）和腫瘤分期（P＜0.001）相關(guān)。然而，OSCC患者的年齡、性別、病理分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與LBP 血清質(zhì)量濃度之間未出現(xiàn)相關(guān)性（圖4）。此結(jié)果與免疫組織化學實驗結(jié)果基本保持一致。

2.4 LBP血清質(zhì)量濃度在OSCC診斷中的價值

本實驗通過繪制ROC 曲線分析血清中LBP 質(zhì)量濃度在OSCC診斷中的價值。其中AUC為0.876（95%CI，0.825～0.917；Z=15.614；P＜0.001），LBP血清質(zhì)量濃度的最佳截斷值為0.733 μg·mL?1，此時的特異性為93.3%，敏感性為80.0%（圖5）。這提示，LBP 血清質(zhì)量濃度可以作為有效的OSCC診斷輔助指標之一。

表2 LBP血清濃度與OSCC患者臨床病理特點的關(guān)系Tab 2 Association between the patient’s clinicopathological characteristics and LBP serum level in OSCC patients

圖4 LBP在OSCC患者以及正常人組的血清質(zhì)量濃度Fig 4 The increased serum level of LBP in OSCC patients

圖5 OSCC組與正常人組ROC曲線Fig 5 ROC curve for OSCC patients vs.normal group

3 討論

本研究首次提出LBP 在人OSCC 中高表達，并且發(fā)現(xiàn)LBP 與OSCC 的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期有關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)其與OSCC 患者的性別、年齡以及病理分級相關(guān)。并且通過ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)LBP 血清質(zhì)量濃度在OSCC 診斷中具有重要價值。

大量研究表明，LBP 在促進癌癥發(fā)展方面可能發(fā)揮重要作用。例如，Boylan等[10]發(fā)現(xiàn)人卵巢癌LBP 蛋白表達量明顯比正常人高。在人結(jié)腸癌中也檢測到LBP 基因異常表達[20?21]。而且，LBP 也被報道有助于癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和不良預后。Kovacs等[11]發(fā)現(xiàn)無論是基因水平還是蛋白水平，LBP 在傳統(tǒng)性腎細胞癌中都顯著高表達，并且隨著臨床分期和病理分級的增加而增高，這對于傳統(tǒng)性腎細胞癌的發(fā)生和不良預后作用突出。在肝細胞癌中也能觀察到類似現(xiàn)象，而且與LBP 低表達組相比，LBP 高表達組的平均總生存期相對減少17 個月，平均復發(fā)時間相對提前13.1 個月[22]。同時，人血清中LBP 的質(zhì)量濃度與非小細胞肺癌呈正相關(guān)，轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌患者血清中LBP表達水平也遠高于非轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌患者[13]。

CD204 主要在腫瘤相關(guān)巨噬細胞中表達，在多種癌癥中有廣泛研究，被認為是腫瘤相關(guān)巨噬細胞的分子標志物。本實驗中表達CD204 的巨噬細胞呈現(xiàn)黃褐色染色，在不同的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期OSCC 中，CD204 表達存在明顯差異，表明CD204 與OSCC 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，這與以往的報道相一致[23]。

已有研究報道，LBP 在巨噬細胞上有表達[9]，本研究通過免疫組織化學雙染實驗發(fā)現(xiàn)共表達在同一細胞的LBP 和CD204 兩者染色相互疊加顯現(xiàn)新的染色，并且此種細胞主要浸潤在腫瘤組織間質(zhì)中，從而證實了LBP 表達在OSCC 的腫瘤相關(guān)巨噬細胞上。體外實驗表明，LPS 刺激與單核細胞共培養(yǎng)的頭頸部鱗狀細胞癌細胞，可以增強巨噬細胞分泌腫瘤促進因子包括CD14、白細胞介素?6 和一氧化氮等，這個過程可以增強頭頸部鱗狀細胞癌細胞系的生長和侵襲[24?25]。進而推測，LBP可能參與腫瘤相關(guān)巨噬細胞與腫瘤細胞的相互作用，促進腫瘤相關(guān)巨噬細胞分泌細胞因子，引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究報道，正常人血清中LBP 質(zhì)量濃度保持在0.5 μg·mL?1以下[5]。本實驗中OSCC 患者的LBP 血清質(zhì)量濃度明顯高于正常人血清中LBP 質(zhì)量濃度，并且血清中LBP 質(zhì)量濃度的最佳臨界值為0.733 μg·mL?1，可以作為有效的OSCC輔助性診斷指標之一。筆者初步發(fā)現(xiàn)，LBP在OSCC 中異常表達，并與腫瘤的臨床分期等有關(guān)，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能起到正向作用。未來有必要深入研究LBP 在調(diào)控OSCC 的發(fā)生發(fā)展過程中潛在的分子機制。

總之，無論是在OSCC 癌組織或者血清中，LBP 表達水平明顯上調(diào)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，提示LBP在OSCC的診斷中具有潛在的臨床價值。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。