陳顯強，邢楠楠，黃亮華，高程海，羅小衛(wèi)，劉永宏**

(1.廣西中醫(yī)藥大學海洋藥物研究院，廣西南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學,廣西中醫(yī)藥科學實驗中心/廣西中醫(yī)基礎研究重點實驗室，廣西南寧 530200)

0 引言

癌癥是威脅人類健康的重大疾病。據(jù)統(tǒng)計，2018年全球有1 810萬新發(fā)癌癥病例和960萬癌癥死亡病例，中國分別約占23.7%和30%，相比其他國家，我國癌癥的發(fā)病率和死亡率最高[1],用于惡性腫瘤的醫(yī)療費用每年超過2 200億，經(jīng)濟損失重大。隨著人口老齡化、工業(yè)化、城市化進程的加劇以及生活方式改變等，中國的癌癥負擔仍會繼續(xù)增加[2]。因此，加強腫瘤防治相關研究，減少腫瘤的發(fā)病率和死亡率，有助于減輕癌癥負擔。

海洋真菌是海洋微生物的重要類群，因為生活在高壓、高鹽、低溫(熱液口為高溫)、低光照、寡營養(yǎng)、低溶氧等獨特環(huán)境條件中，所以海洋真菌可產(chǎn)生具有特異、新穎、化學結構多樣的次級代謝活性物質，已成為化學和藥學等領域關注的焦點[3,4]。海洋真菌的代謝產(chǎn)物富含抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌等活性物質[5-9]，是藥物開發(fā)的重要資源庫[10]。朱偉明教授課題組多次報道海鹽田的嗜鹽真菌具有結構新穎的代謝產(chǎn)物，并發(fā)現(xiàn)多個代謝產(chǎn)物對腫瘤細胞有細胞毒作用[11-14]。然而，細胞毒藥物也會對正常細胞產(chǎn)生毒性，有較大的毒副作用。靶向治療可以明顯減少毒副作用，是當前癌癥治療研究的主流趨勢。成纖維細胞生長因子受體(Fibroblast Growth Factor Receptor,FGFR)過表達與腫瘤進程密切相關，因此，靶向FGFR治療腫瘤成為臨床研究的熱點領域[15]。為進一步探討嗜鹽真菌靶向FGFR抗腫瘤作用，本研究從海鹽田中分離嗜鹽真菌，并開展嗜鹽真菌發(fā)酵提取物的抑制腫瘤細胞增殖作用研究，發(fā)掘和評估靶向抗腫瘤的嗜鹽真菌資源，為今后全方面開展嗜鹽真菌代謝產(chǎn)物靶向FGFR抗腫瘤研究提供依據(jù)和基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

于2019年5月在廣西北海竹林鹽場的海鹽田(21°44′N，109°27′E)采集樣品。采集的樣品放入無菌袋中，將無菌袋放入有冰袋的隔溫箱中帶回實驗室，置于-20℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，100 g海鹽，蒸餾水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基在此基礎上添加15 g瓊脂。

查氏固體培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鈉1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，100 g海鹽，蒸餾水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min。

DMEM/F12(#10-092-CVR)培養(yǎng)基購自Corning Cellgro公司。

1.2 方法

1.2.1 真菌分離

取約2 g新鮮田泥樣品，加入2 mL無菌水，研磨混勻，即為樣品原液；再用無菌水依次稀釋制備10-2、10-3和10-4懸液，每個濃度懸液各取0.2 mL分別涂布于PDA固體培養(yǎng)基和查氏固體培養(yǎng)基中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14-30 d。第1周每天檢查1次，此后每3 d檢查1次，發(fā)現(xiàn)有菌絲長出時，將其轉接到另一新的平板上進行三區(qū)劃線純化，如有雜菌則進行二次純化或多次純化，直至得到單一純凈的菌落，記錄菌落數(shù)及菌落的形態(tài)特征。

1.2.2 真菌鑒定

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，SK8259)提取DNA，然后以ITS1和ITS4為引物，PCR梯度擴增ITS基因序列；再用1%瓊脂糖凝膠電泳(150 V、100 mA、20 min)檢測PCR擴增產(chǎn)物，并用Bio-RAD凝膠成像儀觀察電泳結果；檢驗條帶合格后，采用SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒(BBI，SK8131)純化回收DNA；所得膠回收產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行ITS rDNA測序分析；最后用DNA Star軟件整理測序結果，并利用BLAST數(shù)據(jù)庫比對ITS rDNA基因序列，從中選取相似性較高且是有效描述的典型菌株基因序列作為參比對象。

1.2.3 真菌發(fā)酵及代謝物提取

將對數(shù)生長期的菌株接種于1 L的錐形瓶中(10 mL/瓶)，每瓶含有300 mL PDA液體培養(yǎng)基，共3瓶，25℃靜止發(fā)酵30 d后收集菌絲體；用丙酮提取菌絲體，減壓回收丙酮得到提取物，再用乙酸乙酯萃取，減壓回收得到乙酸乙酯萃取物，低溫保存。

1.2.4 真菌代謝物抑制腫瘤細胞增殖活性檢測

取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞MDA-MB-231和FGFR2過表達的乳腺癌細胞MDA-MB-231 (S252W)，用DMEM/F12培養(yǎng)基(含10% FBS)稀釋至密度為(3—5)×104個/mL，再分別接種至96孔板中，每孔100 μL，37℃孵育過夜。配置含5 mg/mL提取物的培養(yǎng)基，倍比稀釋10個濃度作為給藥濃度，并設定0.2%二甲基亞砜(DMSO)對照組(陰性對照)，設3個復孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL Cell Counting Kit-8 (CCK-8)試劑，置于37℃培養(yǎng)箱中放置 2 h。用微孔板酶標儀讀數(shù)，測定波長為450 nm。抑制率(%)=[(OD對照-OD給藥)/OD對照]×100%。

1.2.5 真菌代謝物抑制FGFR2蛋白激酶活性檢測

用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)[16]檢測真菌乙酸乙酯萃取物對FGFR2酪氨酸激酶酶活的抑制。以Poly (Glu,Tyr) 4∶1為反應底物，將其包埋在酶標板后，在酶標板的對應樣品孔加入1 μL待測試樣品(1 mg/mL)，相應的陰性對照孔加DMSO，設5個復孔；每孔加上50 μL反應緩沖液稀釋的FGFR2激酶(空白對照中用反應緩沖液代替激酶溶液)；再加入5 μmol/L ATP溶液50 μL啟動反應，在37℃、100 r/min條件下反應1 h；T-PBS洗板3次，加入抗體PY99，37℃下反應0.5 h；無鉀PBS洗板3次，加入辣根過氧化物酶標記的抗鼠IgG，37℃下反應0.5 h；最后通過鄰苯二胺(OPD)顯色(25℃避光反應)10 min，終止反應，于490 nm波長測OD值，并按照以下公式計算抑制率：樣品的抑制率(%)=[1-(OD樣品-OD空白)/(OD陰性對照-OD空白)]×100%。

2 結果與分析

2.1 海鹽田的真菌多樣性分析

共分離得到26株菌，根據(jù)菌落形態(tài)特征差異進行初步排重后，所得13株菌進行ITS rRNA基因擴增和序列分析?；贐LAST數(shù)據(jù)庫的比對結果(表1)，被測序菌株屬于11個不同種，分布于2綱2目3科4屬。青霉菌屬(Penicillium)為優(yōu)勢菌屬，含有6種，占分離種的54.54%，其次是曲霉屬(Aspergillus)菌株含有3種，鏈格胞菌屬(Alternaria)和附球菌屬(Epicoccum)各有1種。

表1 11種可培養(yǎng)真菌的物種組成

2.2 真菌發(fā)酵產(chǎn)物抗腫瘤活性分析

各個菌株發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231和FGFR2過表達的乳腺癌細胞MDA-MB-231(S252W)增殖活性結果如表2所示，可知菌株E.sorghinum(編號GXIMD02001)的提取物對FGFR2過表達的乳腺癌細胞MDA-MB-231(S252W)有較強的抑制，其半抑制濃度(Half Maximal Inhibitory Concentration，IC50)為11.02 μg/mL，而對乳腺細胞MDA-MB-231幾乎沒有抑制活性(IC50為1 348 μg/mL)。該實驗結果表明真菌E.sorghinum(編號GXIMD02001)可能是通過靶向FGFR2發(fā)揮抗腫瘤作用。其他菌株提取物對FGFR2過表達和未過表達的乳腺癌細胞增殖抑制活性未顯示差異。兩株真菌A.versicolor(編號GXIMD02004)和P.citrinum(編號GXIMD02009)對乳腺癌細胞MDA-MB-231(S252W)和MDA-MB-231的IC50為11.94-16.41 μg/mL，具有較顯著抗腫瘤活性作用。5株真菌P.oxalicum(編號GXIMD02005)、P.janthinellum(編號GXIMD02006)、P.oxalicum(編號GXIMD02008)、A.alternata(編號GXIMD02011)和P.meleagrinum(編號GXIMD02013)具有較弱的抗乳腺癌作用，IC50為219.2-449.7 μg/mL。

表2 不同真菌的提取物抑制腫瘤細胞增殖活性

2.3 FGFR2蛋白激酶抑制活性分析

用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測菌株E.sorghinum(編號GXIMD02001)發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物，在1 mg/mL濃度下對FGFR2激酶的抑制活性，結果其抑制率為91.5%。該結果從酶水平進一步證明菌株E.sorghinum(編號GXIMD02001)是通過靶向FGFR2發(fā)揮抗腫瘤作用。

3 討論

FGFR是酪氨酸激酶家族重要成員之一，是一類單跨膜糖蛋白分子，主要包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4 4種亞型，由于FGFR基因突變和擴增導致FGFR蛋白激酶過表達，F(xiàn)GFR持續(xù)激活從而誘導腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移，促進血管生成以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。FGFR2過表達能夠激活下游關鍵的信號通路，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[18]。

已上市和臨床在研的FGFR小分子抑制劑可分為多靶點抑制劑與選擇性FGFR抑制劑。多靶點抑制劑如已上市藥物Ponatinib、Nintedanib、Dovitinib和Lenvatinib均靶向于FGFR、VEGFR和PDGFR等多個激酶靶點[19-22]。這些多靶點FGFR抑制劑存在嚴重的毒副作用，主要是因其抑制VEGFR而引起高血壓、蛋白尿、胃腸病變和皮膚反應等[23]。與多靶點FGFR抑制劑相比較，選擇性FGFR抑制劑更加選擇性地靶向抑制FGFR，利于療效的發(fā)揮，規(guī)避多靶點FGFR抑制劑的毒性反應，更符合當下精準醫(yī)療的個性化用藥的需求。2019年美國FDA加速批準的Pan-FGFR抑制劑Erdafitinib,可用于治療局部晚期或轉移性膀胱癌，是首個獲批上市的選擇性FGFR抑制劑[24]。目前，僅有少量選擇性FGFR抑制劑進入臨床研究，包括3個臨床三期(TAS-120、NVP-BGJ398和AZD4547)，1個臨床二期和4個臨床一期[25]。

本研究從北部灣海洋高鹽環(huán)境中發(fā)現(xiàn)若干株具有抗腫瘤活性的真菌，其中，真菌E.sorghinum(編號GXIMD02001)對FGFR2過表達乳腺癌細胞有抑制增殖作用，并在酶水平上進一步驗證其可能靶向FGFR2蛋白激酶發(fā)揮抗腫瘤作用，是首次報道海洋真菌靶向FGFR2抗腫瘤作用，對后續(xù)靶向抗腫瘤活性分子的挖掘具有重要的意義。然而，目前的研究對象是提取物，其具體的藥效物質基礎還不清楚，需要借助多學科交叉技術，結合化學信息和生物活性評價，充分闡明其靶向FGFR2抗腫瘤藥效的物質基礎。深入研究這些菌株的代謝產(chǎn)物將有利于北部灣海洋藥用資源的開發(fā)和利用，有助于抗腫瘤先導化合物的發(fā)現(xiàn)，幫助人類對抗惡性腫瘤的威脅以及減輕經(jīng)濟負擔。

4 結論

本研究從高鹽環(huán)境中共分離得到26株嗜鹽真菌，經(jīng)初步排重后獲得13株菌，分子鑒定結果顯示隸屬于3科4屬11種，其中青霉菌屬菌株(Penicillium)為優(yōu)勢菌群。真菌E.sorghinum(編號GXIMD02001)靶向FGFR2發(fā)揮抗腫瘤作用，這是首次報道海洋真菌具有靶向FGFR2抗腫瘤作用。真菌A.versicolor(編號GXIMD02004)和P.citrinum(編號GXIMD02009)顯著抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231和MDA-MB-231(S252W)增殖。5株真菌P.oxalicum(編號GXIMD02005)、P.janthinellum(編號GXIMD02006)、P.oxalicum(編號GXIMD02008)、A.alternata(編號GXIMD02011)和P.meleagrinum(編號GXIMD02013)具有較弱的抗乳腺癌作用。本研究為北部灣海洋微生資源的抗腫瘤藥物開發(fā)利用奠定基礎。