駱時(shí)木，葉宇宸，歐陽航，葉玉華，張志珊

福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建泉州 362000

轉(zhuǎn)錄因子7類似物2(TCF7L2)是一種轉(zhuǎn)錄因子，為高遷移率族蛋白家族的成員。研究發(fā)現(xiàn)TCF7L2基因多態(tài)性與2型糖尿病(T2DM)有關(guān)，在TCF7L2基因眾多單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)中，rs7903146位點(diǎn)是目前研究較熱門的位點(diǎn)之一，且被證實(shí)在不同的國家和人群中與T2DM易感性有緊密聯(lián)系[1-2]。該位點(diǎn)的多態(tài)性對靶基因啟動(dòng)子的活性和轉(zhuǎn)錄概率的影響較強(qiáng)[3]，在Wnt信號通路中，TCF7L2自我表達(dá)的調(diào)節(jié)有重要作用[4]，但rs7903146位點(diǎn)與T2DM合并冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CHD)的相關(guān)性報(bào)道較少。本研究選擇TCF7L2基因rs7903146位點(diǎn)作為研究位點(diǎn)，旨在分析其與T2DM合并CHD的相關(guān)性及對體內(nèi)血糖和血脂水平的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年12月至2018年6月本院內(nèi)分泌科就診的T2DM患者100例為單純T2DM組，其中男58例、女42例，平均年齡(57.73±11.76)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照我國2007年糖尿病防治指南：有糖尿病癥狀并伴有隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L,或空腹血糖≥7.0 mmol/L，或既往有確切糖尿病病史，并在使用降糖藥物或胰島素者。選取同期本院心內(nèi)科住院的CHD患者100例為單純CHD組，其中男67例、女33例，平均年齡(62.09±13.33)歲。CHD的診斷標(biāo)準(zhǔn)：冠狀動(dòng)脈造影檢查證實(shí)冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%或既往有明確心肌梗死病史。選取同期心內(nèi)科因CHD住院的T2DM患者100例為T2DM合并CHD組，其中男63例、女37例，平均年齡(65.28±11.22)歲。T2DM合并CHD的診斷標(biāo)準(zhǔn)同上。選取同期本院體檢中心的體檢健康者100例為對照組，其中男53例，女47例，平均年齡(53.35±10.96)歲，經(jīng)檢查排除CHD，同時(shí)無高血壓、糖尿病等病史。所有研究對象主要來自福建泉州地區(qū)的漢族人群，無血緣關(guān)系。均排除肝臟疾病、腎病綜合征、甲狀腺或腎上腺疾病等影響血脂代謝的疾病，且近1個(gè)月內(nèi)未使用降脂藥物。本研究得到了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有研究對象均在試驗(yàn)前了解本研究的目的，并簽署知情同意書。

1.2方法 (1)標(biāo)本采集：所有研究對象均禁食12～14 h后，于次日清晨采肘靜脈血2管。1管用乙二胺四乙酸二鉀抗凝，進(jìn)行糖化血紅蛋白(HbA1c)檢測后，標(biāo)本放置-80 ℃冰箱待提取基因組DNA。另1管不抗凝，于2 h內(nèi)3 000 r/min離心5 min后分離血清，用于生化指標(biāo)的檢測。(2)基因多態(tài)性檢測：采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)TCF7L2基因rs7903146位點(diǎn)引物，上游為5′-AGT TTT ATT GGA GGG TTG CAC-3；下游為5′-TAG CGA AGA GAT GAA ATG TAG C-3′，引物由日本Takara公司合成。采用Qiagen試劑進(jìn)行DNA的提取，BioTeke濃度檢測儀檢測其DNA濃度及純度。PCR反應(yīng)總體積30 μL，包括10×buffer 3 μL，dNTP 2.4 μL，正向引物和反向引物各0.6 μL，模板DNA 1.5 μL，Taq酶0.15 μL及ddH2O 21.75 μL。PCR循環(huán)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行35次循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用3%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，溴化乙啶染色，使用凝膠成像儀觀察結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序，Chromas軟件分析測序結(jié)果。(3)生化指標(biāo)檢測：采用高效液相色譜法(日本愛科來HA8180糖基化血紅蛋白儀)檢測HbA1c，采用美國貝克曼庫爾特全自動(dòng)生化分析儀測定血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、載脂蛋白(Apo)A、ApoB。試驗(yàn)均嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行操作，采用高低2個(gè)水平配套質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)量控制，所有生化項(xiàng)目均取得中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)和福建省臨檢中心室間質(zhì)量評價(jià)合格證書。

2 結(jié) 果

2.14組一般臨床資料比較 與對照組比較，T2DM組、CHD組、T2DM+CHD組年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、飲酒和吸煙人數(shù)，以及HbA1c、HDL-C、ApoA、ApoB水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2TCF7L2基因rs7903146位點(diǎn)基因型分析 經(jīng)PCR擴(kuò)增后，TCF7L2基因rs7903146位點(diǎn)基因片段為398 bp。將其DNA測序結(jié)果與GenBank參考序列比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs7903146位點(diǎn)存在2種基因多態(tài)性，CC基因型和CT基因型，未發(fā)現(xiàn)TT基因型，測序結(jié)果見圖1。

2.34組Hardy-Weinberg遺傳平衡分析 4組TCF7L2基因rs7903146位點(diǎn)多態(tài)性分布情況均符合Hardy-Weinberg平衡，對照組：χ2=0.066，P>0.05；T2DM組：χ2=0.222，P>0.05；CHD組：χ2=0.132，P>0.05；T2DM+CHD組：χ2=0.174，P>0.05)。所研究的基因型頻數(shù)和預(yù)期的基因型頻數(shù)相符合，具有群體代表性。

表1 4組一般臨床資料比較

組別TC(x±s,mmol/L)TG(x±s,mmol/L)HDL-C(x±s,mmol/L)LDL-C(x±s,mmol/L)ApoA(x±s,mmol/L)ApoB(x±s,mmol/L)對照組5.00±0.771.27±0.371.37±0.343.04±0.791.51±0.261.09±0.25T2DM組5.15±1.581.96±0.09a1.03±0.29a3.23±1.221.07±0.23a0.90±0.27aCHD組4.89±1.431.50±0.33b1.01±0.25a3.19±1.371.08±0.19a0.90±0.28aT2DM+CHD組4.69±1.43b1.97±0.41ac0.88±0.19abc2.90±1.071.01±0.18ab0.95±0.33a

注：A為野生型CC基因型；B為雜合型CT基因型。

2.44組基因型頻率分布比較 4組攜帶CT突變雜合子者29例，其中對照組5例，T2DM組9例，CHD組7例，T2DM+CHD組8例，4組基因型頻率分布組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.54組不同基因型生化指標(biāo)的比較 4組TCF7L2基因rs7903146位點(diǎn)各基因型間相關(guān)指標(biāo)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.6T2DM合并CHD的Logistic回歸分析 將全部研究對象作為整體進(jìn)行二分類Logistic回歸分析二分類劃分，將是否有T2MD合并CHD(否為0，有為1)作為因變量，其他指標(biāo)作為自變量。結(jié)果顯示，高齡、高水平HbA1c是發(fā)生T2DM合并CHD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，低水平HDL-C是預(yù)防T2DM合并CHD的保護(hù)因素。rs7903146位點(diǎn)基因型不是發(fā)生T2DM合并CHD的影響因素，見表4。

表2 4組基因型頻率分布比較(n)

表3 4組不同基因型相關(guān)指標(biāo)的比較

表4 T2DM合并CHD的Logistic回歸分析

3 討 論

與T2DM相關(guān)的基因中TCF7L2基因是研究較為深入的基因之一。TCF7L2作為Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑的核受體，在β-連環(huán)蛋白的誘導(dǎo)下結(jié)合基因中的Wnt反應(yīng)元件[5]，β-連環(huán)蛋白與T細(xì)胞因子4形成復(fù)合物參與多種生物事件，特別是在胰腺和胰島發(fā)育中起著關(guān)鍵作用[6]，這影響著T2DM的發(fā)生與發(fā)展。此外，Wnt信號可利用β-連環(huán)蛋白/T細(xì)胞因子4介導(dǎo)腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等多種靶基因的表達(dá)[7]，此類細(xì)胞因子可介導(dǎo)血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)，促使血管壁增厚、管腔狹窄，從而增加心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

本研究通過對對照組、T2DM組、CHD組、T2DM合并CHD組TCF7L2基因rs7903146位點(diǎn)基因多態(tài)性分布分析發(fā)現(xiàn)，4組基因多態(tài)性分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此結(jié)果與陳鐵暉等[8]結(jié)果相符。在此前亦有許多關(guān)于TCF7L2基因rs7903146位點(diǎn)基因多態(tài)性的研究，但其結(jié)論不一，梁偉等[9]研究認(rèn)為TCF7L2基因rs7903146位點(diǎn)多態(tài)性TT+CT基因型、等位基因T是T2DM患者的危險(xiǎn)因素；王志強(qiáng)等[10]研究新疆維吾爾族人群也認(rèn)為該位點(diǎn)與T2DM有關(guān)聯(lián)，CT基因型、T等位基因都是T2DM患者的危險(xiǎn)因素，而也有學(xué)者研究該地區(qū)漢族人群則認(rèn)為rs7903146位點(diǎn)基因多態(tài)性與T2DM不相關(guān)[11]；AXEL等[12]報(bào)道了奧地利人群中攜帶rs7903146 T等位基因的人群患CHD的風(fēng)險(xiǎn)較高，這種關(guān)聯(lián)在T2DM患者中較強(qiáng)，而CORELLA等[13]報(bào)道未發(fā)現(xiàn)rs7903146位點(diǎn)基因多態(tài)性與心血管事件的相關(guān)性。研究結(jié)果不一致可能是因?yàn)槊總€(gè)研究中患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征不同，或者與不同環(huán)境因素有關(guān)。同時(shí)，不同種族及地域也有可能是其影響因素。在本研究中亦未發(fā)現(xiàn)研究人群 rs7903146位點(diǎn)基因多態(tài)性與T2DM合并CHD患者的聯(lián)系。

TCF7L2基因是利用Wnt通路來調(diào)節(jié)腸內(nèi)分泌細(xì)胞中的胰高血糖素，從而影響血糖的平衡，亦有研究認(rèn)為，TCF7L2基因多態(tài)性與脂類代謝有關(guān)[14]。PALIZBAN等[14]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)rs7903146位點(diǎn)C突變成T時(shí)，在血脂異常中將發(fā)揮重要作用。CORELLA等[15]研究發(fā)現(xiàn)肥胖人群與rs7903146位點(diǎn)基因多態(tài)性有相互作用，與不肥胖者比較，肥胖患者發(fā)生T2DM的風(fēng)險(xiǎn)更高。有研究表明rs7903146位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與糖尿病腎病、高血壓及血脂異常等發(fā)病機(jī)制有關(guān)[16-20]。趙曉宇等[21]報(bào)道在中國北方人群中 TCF7L2基因rs11196218位點(diǎn)A/G與血脂異常相關(guān)。因此，本研究還對各組CC、CT基因型的HbA1c和血糖、血脂指標(biāo)進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究中Logistic回歸分析結(jié)果顯示高齡、高水平HbA1c是發(fā)生T2DM合并CHD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，低水平HDL-C是預(yù)防T2DM合并CHD的保護(hù)因素，rs7903146位點(diǎn)基因型不是發(fā)生T2DM合并CHD的影響因素。

本研究顯示rs7903146位點(diǎn)各基因型生化水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但考慮到研究的樣本量不夠多，男女比例不平衡，組間年齡也有差異，且存在抽樣誤差的可能。因此，在評價(jià)結(jié)果時(shí)，需要考慮到這些因素不平衡帶來的影響。此外，遺傳背景、環(huán)境條件、生活方式、飲食習(xí)慣等諸多因素對疾病的影響亦不能忽視。

綜上所述，TCF7L2基因rs7903146位點(diǎn)基因多態(tài)性與T2DM合并CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、血糖、血脂水平無關(guān)。