吳 爽，張濤元，李 俏，曹三成，祝擷英△

1.西安交通大學(xué)附屬西安市兒童醫(yī)院檢驗科，陜西西安 710003；2.日照心臟病醫(yī)院麻醉科，山東日照 276800

胃癌的惡性程度和病死率均較高，由于胃癌在早期缺乏特異性癥狀，導(dǎo)致其早期診斷率較低[1]。目前已發(fā)現(xiàn)許多基因參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，但胃癌的發(fā)病機制仍未完全被揭示[2]。人類基因組中CBX家族共包含8個基因，均與異染色質(zhì)、基因表達(dá)及生長發(fā)育等生物過程密切相關(guān)。生物信息學(xué)技術(shù)分析結(jié)果表明CBX1在肝細(xì)胞癌、乳腺癌等多種癌癥中發(fā)揮重要作用[3]，然而其在胃癌中的作用機制仍不明確。

微陣列技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)已被廣泛用于鑒定基因組的表達(dá)水平，幫助識別與癌癥相關(guān)的差異表達(dá)基因和相關(guān)信號通路[4]。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，分析胃癌中CBX1的表達(dá)情況，探究CBX1與胃癌患者病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)聯(lián)，聚焦其在胃癌中可能參與的生物學(xué)過程，提供胃癌早期診斷和預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1CBX1在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異的驗證 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫[5]，比較CBX1在胃癌組織與正常胃組織中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異，同時獲取胃癌組織與正常胃組織中CBX1的研究數(shù)據(jù)，參數(shù)設(shè)置如下：t檢驗，P=0.01，變化倍數(shù)為1.5倍，基因等級為10%，類型為mRNA。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫中腫瘤基因組圖譜與基因表達(dá)項目(GTEx)的數(shù)據(jù)，分析驗證CBX1在正常胃組織與胃癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異，參數(shù)設(shè)置如下：方差分析，|Log2(FC)|最佳臨界值為1.0，q=0.01。

1.2蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)驗證CBX1在正常胃黏膜細(xì)胞GSE-1和胃癌細(xì)胞SGC7901中的表達(dá)差異 兔抗人CBX1(PA5-28448)抗體購自美國Invitrogen Ebioscience公司，GAPDH抗體購自英國Abcom公司。將等量的正常胃黏膜細(xì)胞GSE-1及胃癌細(xì)胞SGC7901接種于10 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)48 h以后提取蛋白，檢測濃度后，進(jìn)行Western blot實驗，以GAPDH為內(nèi)參，分析兩種細(xì)胞中CBX1蛋白表達(dá)水平的差異。

1.3免疫組化驗證CBX1在正常胃組織和胃癌組織中的表達(dá)差異 在Human Protein Atlas[6]網(wǎng)站(https://www.proteinatlas.org)中，利用免疫組化數(shù)據(jù)，從蛋白表達(dá)水平驗證CBX1在胃癌組織與正常胃組織中的表達(dá)差異，所用抗體為HPA031762。

1.4CBX1與胃癌患者臨床病理參數(shù)的分析 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫[7]，分析CBX1的mRNA表達(dá)情況與胃癌患者的癌癥分期和腫瘤分級之間的相關(guān)性。利用Kaplan Meier-Plotter在線分析工具，分析CBX1與胃癌患者總生存期(OS)的相關(guān)性。依據(jù)胃癌患者CBX1表達(dá)值的中位數(shù)，分為高表達(dá)和低表達(dá)2組，計算風(fēng)險比、95%置信區(qū)間和相應(yīng)P值，制作生存曲線。

1.5CBX1關(guān)聯(lián)基因的篩選及富集分析 使用GEPIA數(shù)據(jù)庫獲取與CBX1在胃癌中具有相似表達(dá)的基因，應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫[8]及Scytoscape[9]軟件，構(gòu)建并可視化蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)；利用Metascape網(wǎng)站對相似基因進(jìn)行基因本體(GO)富集分析；利用Starbase網(wǎng)站進(jìn)行相似基因的京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，各數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗和方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CBX1的mRNA水平在胃癌組織的表達(dá)情況 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析顯示：與正常組織比較，CBX1的mRNA水平在大多數(shù)腫瘤組織中高表達(dá)，見圖1A；其中有6組數(shù)據(jù)顯示CBX1的mRNA在胃癌組織中高表達(dá)，見圖1B、表1。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫對胃癌中CBX1的mRNA表達(dá)情況加以驗證，結(jié)果表明，CBX1的mRNA在胃癌組織高表達(dá)，見圖1C。

表1 不同類型胃癌與正常胃組織CBX1轉(zhuǎn)錄水平的變化(Oncomine數(shù)據(jù)庫)

2.2CBX1的Western blot結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示，CBX1在GSE-1細(xì)胞中的表達(dá)水平低于SGC7901細(xì)胞，即CBX1在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，見圖2。

2.3CBX1的免疫組化結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，CBX1在正常胃組織中低表達(dá)，胃癌組織中高表達(dá)，見圖3。

注：A為CBX1在多種腫瘤中的表達(dá)情況；B為6組胃癌數(shù)據(jù)中CBX1的表達(dá)情況；C為CBX1在胃癌組織與正常胃組織中mRNA表達(dá)情況。

圖2 CBX1的Western blot結(jié)果

注：A為CBX1在正常胃組織中的表達(dá)情況；B為CBX1在胃癌組織中的表達(dá)情況。

2.4CBX1與胃癌患者病理參數(shù)的相關(guān)性分析 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫對CBX1進(jìn)行胃癌患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析，結(jié)果顯示在腫瘤分級中，正常組織vs.2級胃癌組織(P=1.56E-4)、正常組織vs.3級胃癌組織(P=4.12E-5)、1級胃癌組織vs.3級胃癌組織(P=0.00)的mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4A；在癌癥分期中，正常組織vs.2期胃癌組織(P=9.98E-5)、正常組織vs.3期胃癌組織(P=5.58E-5)、正常組織vs.4期胃癌組織(P=9.46E-3)、3期胃癌組織vs.4期胃癌組織(P=4.22E-2)的mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4B。利用Kaplan Meier-Plotter在線分析工具進(jìn)行CBX1與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)分析，并繪制生存曲線圖，結(jié)果顯示：CBX1高表達(dá)組患者的生存率遠(yuǎn)低于CBX1低表達(dá)組，見圖4C。

注：A為CBX1在不同的腫瘤分級中的mRNA相對表達(dá)水平；B為CBX1在不同癌癥分期中的mRNA相對表達(dá)水平；C為CBX1表達(dá)與胃癌患者生存率的關(guān)系。

2.5CBX1在胃癌中的相似基因及其PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫，在胃癌組織中共獲得與CBX1表達(dá)有相似性的基因50個，在STRING網(wǎng)站中這些基因共構(gòu)建出含有51個點，985條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，Cytoscape 的MCODE插件，獲取其中相互作用程度最高的43個點，877條邊組成的核心網(wǎng)絡(luò)，見圖5。

圖5 CBX1的PPI可視化結(jié)果

2.6GO富集分析及KEGG通路富集分析 GO富集分析結(jié)果顯示，43個基因的生物學(xué)功能主要聚集在組蛋白修飾、mRNA組裝及染色體有絲分裂過程，見6A。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，43個基因主要涉及的通路包括核糖體及氨基酸的生物合成途徑，見圖6B。

注：A為GO富集分析圖；B為KEGG通路富集分析圖。

3 討 論

目前，分子生物標(biāo)志物在疾病的診斷、預(yù)后和精準(zhǔn)治療中發(fā)揮重要的作用。隨著檢測技術(shù)和治療手段的提高，胃癌發(fā)病率有所下降，但仍是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤[10]。胃癌的危險因素主要包括幽門螺桿菌感染、不當(dāng)飲食、不潔飲食及吸煙等，而早期診斷的缺乏和腫瘤的轉(zhuǎn)移、擴散則是其主要致死原因[11]。因此，亟須探索更多的分子標(biāo)志物用于胃癌的早期診斷和靶向治療。

CBX1參與了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的遺傳調(diào)控過程[12]，有研究證實，CBX1能夠在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，且其高表達(dá)與肝癌患者預(yù)后不良相關(guān)[3]；而在關(guān)于垂體瘤的一項研究中發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的CBX1能夠?qū)е麓贵w瘤的發(fā)生[13]；在前列腺癌中，CBX1高表達(dá)與組蛋白H3K3的甲基化密切相關(guān)[14]。本研究通過兩組不同來源的數(shù)據(jù)庫——Oncomine數(shù)據(jù)庫及GEPIA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)CBX1的mRNA水平在胃癌組織中明顯升高，之后利用Western blot和免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)CBX1蛋白在胃癌細(xì)胞SGC7901及胃癌組織中高表達(dá)，這些數(shù)據(jù)表明CBX1的高表達(dá)與胃癌有相關(guān)性。UALCAN數(shù)據(jù)庫的臨床數(shù)據(jù)分析顯示，CBX1的mRNA表達(dá)在胃癌的不同分級、分期中均有差異，即隨著腫瘤的發(fā)展，CBX1的mRNA水平也隨之升高，預(yù)示著CBX1可以作為胃癌早期診斷及癌癥進(jìn)展的標(biāo)志物。生存分析結(jié)果顯示，CBX1高表達(dá)與胃癌患者的生存率相關(guān)，風(fēng)險比高達(dá)2.09，提示CBX1可以作為胃癌預(yù)后不良的危險因素。通過尋找在胃癌中與CBX1有相似表達(dá)的基因，篩選出43個作用緊密的基因集，富集分析顯示，這些基因主要參與組蛋白修飾、mRNA組裝及染色體有絲分裂等生物過程，這與CBX1參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)調(diào)控的功能類似，同時也與目前已經(jīng)報道的組蛋白和染色體對腫瘤細(xì)胞的調(diào)控機制相吻合[13-14]。組蛋白的去乙?；c腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，組蛋白H3和H4的乙?；揎棻蛔C實參與了胃癌的發(fā)生。染色體的非整倍性是腫瘤細(xì)胞的常見特征，也是腫瘤發(fā)生的原因之一，而一些針對有絲分裂紡錘體聚合物的藥物也早已被頻繁地用來治療各類腫瘤。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法，分析了正常胃組織與胃癌組織中CBX1的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)CBX1與胃癌的分級、分期和患者遠(yuǎn)期預(yù)后相關(guān)，并分析了CBX1在胃癌中可能參與的生物學(xué)過程，有助于進(jìn)一步揭示胃癌發(fā)生、發(fā)展可能涉及的分子機制，為胃癌提供早期診斷和預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物。但是，本研究有一定局限，缺乏有效的分子生物學(xué)實驗，對這些基因在胃癌組織中的功能進(jìn)行分析驗證；同時，在進(jìn)行CBX1與胃癌患者臨床病理參數(shù)相關(guān)分析時，由于此數(shù)據(jù)分期與分級所納入病例數(shù)較少，有可能對結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。盡管如此，本研究仍有利于全面深入了解胃癌的潛在分子機制，并為后續(xù)的分子生物實驗提供指導(dǎo)。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)分析，闡明了CBX1的表達(dá)與胃癌發(fā)生及胃癌患者病理參數(shù)之間的相關(guān)性，初步證實了CBX1可作為胃癌早期診斷及預(yù)后的標(biāo)志物。