黃彩芝，張 聰，唐 蓮，莫麗亞

湖南省兒童醫(yī)院：1.檢驗(yàn)中心；2.肝病中心，湖南長(zhǎng)沙 410007

乙型肝炎病毒(HBV)感染仍然是全球性的重大公共衛(wèi)生問題，每年約有一百萬(wàn)人死于HBV感染[1]。HBV感染后可導(dǎo)致慢性乙型肝炎(CHB)、肝纖維化、肝硬化及肝細(xì)胞癌，兒童感染HBV后更容易發(fā)展為慢性感染，其中新生兒乙型肝炎慢性化率為80%～90%、小于6歲兒童乙型肝炎慢性化率為25%～30%，而成人乙型肝炎慢性化率不超過5%[2]。人類感染HBV的轉(zhuǎn)歸與病毒本身、環(huán)境、宿主免疫狀態(tài)和遺傳易感性等多種因素有關(guān)。有研究表明，維生素D受體(VDR)基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與HBV宿主遺傳易感性，HBV感染后的免疫調(diào)節(jié)、治療反應(yīng)、疾病進(jìn)程及臨床結(jié)局等密切相關(guān)[3-6]，但關(guān)于VDR基因SNPs與兒童CHB關(guān)系的相關(guān)報(bào)道較少。本研究通過觀察CHB患兒VDR基因位點(diǎn)[BsmI(rs1544410)、ApaI(rs7975232)、TaqI(rs731236)、FokI(rs2228570)]的基因型和等位基因頻率分布，初步探討VDR基因SNPs與兒童CHB的遺傳易感性、HBV基因型、肝臟病變嚴(yán)重程度及血清25羥維生素D[25(OH)D]水平的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016-2019年夏秋季節(jié)(每年5—10月)就診于本院肝病中心的CHB患兒189例作為CHB組，其中男124例，女65例；年齡[61.00(37.50～97.50)]個(gè)月。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡為1個(gè)月至14歲；(2)CHB診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)和肝病學(xué)分會(huì)制訂的《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他肝臟疾病、感染性疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病、血液系統(tǒng)疾病、先天性免疫功能異常等；(2)入院前4周內(nèi)服用維生素D制劑或免疫調(diào)節(jié)劑。

采用組織病理活檢的方法衡量肝臟炎癥活動(dòng)度和纖維化程度[8]，根據(jù)肝臟病變嚴(yán)重程度將CHB患兒分為輕度組和中度組，根據(jù)HBV基因型將CHB患兒分為HBV B型組和HBV C型組。另選擇同期在本院兒童保健所體檢的健康兒童56例作為對(duì)照組，其中男36例，女20例；年齡[59.50(32.25～95.25)]個(gè)月。CHB組與對(duì)照組年齡(Z=0.648，P=0.517)與性別比較(χ2=0.033，P=0.855)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選兒童均征得監(jiān)護(hù)人知情同意。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集和處理 采集CHB組和對(duì)照組兒童空腹靜脈血3～4 mL，其中1 mL使用乙二胺四乙酸抗凝后用于DNA提取，2～3 mL未抗凝血分離血清用于HBV基因分型及25(OH)D水平檢測(cè)。

1.2.2DNA提取 采用DNA提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)提取乙二胺四乙酸抗凝血液中的DNA，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度及純度，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3VDR基因SNPs檢測(cè) 采用單堿基延伸技術(shù)通過多重PCR反應(yīng)體系檢測(cè)VDR基因位點(diǎn)BsmI(rs1544410)、ApaI(rs7975232)、TaqI(rs731236)、FokI(rs2228570)的多態(tài)性。PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI公司提供的ABI Veriti DX擴(kuò)增儀。BsmI位點(diǎn)的上游引物：TCT GAG GAA CTA GAT AAG CAG，下游引物：CAG GAA TGT TGA GCC CAG TT；ApaI位點(diǎn)的上游引物：GGA TAG AGA AGA AGG CAC AG，下游引物：CGG TCA GCA GTC ATA GAG G； TaqI位點(diǎn)的上游引物：GCT CCT GTG CCT TCT TCT C，下游引物：GAT GTA CGT CTG CAG TGT G；FokI位點(diǎn)的上游引物：GGT GGC ACC AAG GAT G，下游引物：CAA AGT CTC CAG GGT CAG G。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共45個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物純化后行SNaPshot PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：96 ℃預(yù)變性10 s，96 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；最后4 ℃恒溫。SNaPshot PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)毛細(xì)管電泳，利用美國(guó)ABI公司提供的3500Dx基因測(cè)序儀完成位點(diǎn)測(cè)序，分析軟件為GeneMapper 5.0。

1.2.4HBV基因分型 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，由金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所完成CHB患兒的HBV基因分型。

1.2.5血清25(OH)D水平檢測(cè) 采用化學(xué)發(fā)光法，儀器和試劑為美國(guó)西門子ADVIA Centaur XP全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M(P25，P75)]表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-WallisH非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；對(duì)照組進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)對(duì)組間基因型及等位基因頻率進(jìn)行比較，以比值比(OR)和95%置信區(qū)間(CI)表示暴露于某個(gè)基因型或等位基因后發(fā)生CHB或感染某種HBV基因型或較嚴(yán)重肝臟病變的危險(xiǎn)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1研究對(duì)象一般情況 CHB患兒中有139例進(jìn)行了HBV基因分型，其中HBV B型組118例，HBV C型組21例；120例CHB患兒行B超引導(dǎo)下肝臟穿刺組織病理活檢，經(jīng)檢查，肝臟炎癥活動(dòng)度情況為G1級(jí)53例、G2級(jí)25例、G3級(jí)42例；纖維化程度分別為S0期24例、S1期73例、S2期12例、S3期9例、S4期2例；其中78例患兒經(jīng)組織病理活檢診斷為輕度CHB(輕度組)，42例患兒經(jīng)組織病理活檢診斷為中度CHB(中度組)。

2.2CHB組與對(duì)照組VDR基因位點(diǎn)基因型與等位基因頻率分布 經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，對(duì)照組兒童VDR基因 BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4個(gè)位點(diǎn)基因型頻率符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律(χ2=0.077、2.900、0.019、2.357，均P>0.05)，表明標(biāo)本選取具有群體代表性。

位于VDR基因ApaI位點(diǎn)的基因型在CHB組和對(duì)照組間的頻率分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CHB組的AC基因型(43.90%)頻率分布高于對(duì)照組(26.8%)，提示與ApaI CC基因型比較，AC基因型可能增加兒童HBV感染的風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.213，95%CI1.130～4.335)。而BsmI、TaqI和FokI 3個(gè)位點(diǎn)的基因型在CHB組和對(duì)照組中的頻率分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。VDR 基因BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4個(gè)位點(diǎn)的等位基因在CHB組和對(duì)照組中的頻率分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3CHB患兒輕度組與中度組VDR基因位點(diǎn)基因型與等位基因頻率分布 VDR基因 BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4個(gè)位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布在輕度組和中度組CHB患兒中比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.4CHB患兒HBV B型組與HBV C型組VDR基因位點(diǎn)基因型與等位基因頻率分布 HBV B型組與HBV C型組CHB患兒中，VDR基因BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4個(gè)位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表1 CHB組與對(duì)照組VDR基因位點(diǎn)基因型與等位基因頻率分布[n(%)]

表2 CHB患兒輕度組與中度組VDR基因位點(diǎn)基因型與等位基因頻率分布[n(%)]

續(xù)表2 CHB患兒輕度組與中度組VDR基因位點(diǎn)基因型與等位基因頻率分布[n(%)]

表3 HBV B型組與HBV C型組VDR基因位點(diǎn)基因型與等位基因頻率分布[n(%)]

2.5CHB患兒VDR基因位點(diǎn)不同基因型間血清25(OH)D水平比較 CHB患兒VDR基因BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4個(gè)位點(diǎn)不同基因型間血清25(OH)D水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 CHB患兒VDR基因位點(diǎn)不同基因型血清25(OH)D水平比較[M(P25，P75)]

續(xù)表4 CHB患兒VDR基因位點(diǎn)不同基因型血清25(OH)D水平比較[M(P25，P75)]

3 討 論

VDR屬于類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員，是存在于多種細(xì)胞核和細(xì)胞膜上的可溶性蛋白，主要分布于心、腦、腎臟、肝臟、皮膚等多種組織器官中，以及巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等各種免疫細(xì)胞中，此外在許多腫瘤細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了VDR的表達(dá)。VDR基因定位于12號(hào)染色體長(zhǎng)臂，含427個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為50×103。VDR通過調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)活性維生素D發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的固有免疫與適應(yīng)性免疫反應(yīng)。研究表明活性維生素D-VDR信號(hào)通路參與了涉及人體生理功能的900多種基因的表達(dá)與調(diào)控[9]，VDR基因多態(tài)性除了與鈣磷代謝有關(guān)外，還與腫瘤、代謝性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病等多種疾病的病理生理機(jī)制密切相關(guān)[3,10-14]。目前已發(fā)現(xiàn)的VDR基因多態(tài)性主要集中在4個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別為第8內(nèi)含子的BsmI位點(diǎn)和ApaI位點(diǎn)、第9外顯子的TaqI位點(diǎn)及第2外顯子的FokI位點(diǎn)。

近年來(lái)VDR基因SNPs與CHB關(guān)系的研究日益受到重視，VDR SNPs可以改變其編碼的VDR蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能，HBV可能通過下調(diào)VDR的表達(dá)水平阻止活性維生素D對(duì)HBV轉(zhuǎn)錄與翻譯的抑制作用[4]，同時(shí)VDR與活性維生素D結(jié)合后可抑制1型輔助性T細(xì)胞的增殖與細(xì)胞因子的分泌，并激活2型輔助性T細(xì)胞的應(yīng)答從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[15]，而CHB患者HBV的清除主要依賴于以1型輔助性T細(xì)胞應(yīng)答為主的細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此VDR基因的不同表達(dá)可能與HBV易感性及疾病進(jìn)程有一定的相關(guān)性。有研究指出，攜帶VDR FokI基因型CC、CT及等位基因C的個(gè)體具有更高的HBV易感性，CT與TT基因型的CHB患者對(duì)聚乙二醇干擾素的治療反應(yīng)更強(qiáng)，F(xiàn)okI基因SNPs可作為HBV感染后預(yù)示肝細(xì)胞癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、評(píng)估疾病嚴(yán)重程度的分子標(biāo)志物[3,5,16]；TaqI TT基因型和T等位基因與無(wú)癥狀HBV感染有關(guān)[17-18]；ApaI AA基因型與CHB患者高病毒載量和肝病嚴(yán)重程度相關(guān)[18]；BsmI BB基因型與HBV感染轉(zhuǎn)歸有一定的聯(lián)系[19]。而HE等[3]的Meta分析研究表明，BsmI、ApaI、TaqI位點(diǎn)的多態(tài)性與HBV易感性并無(wú)聯(lián)系，HOAN等[6]的研究亦指出，VDR基因BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性均與HBV感染風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)，但ApaI位點(diǎn)的多態(tài)性與HBV感染患者的臨床結(jié)局和疾病進(jìn)展相關(guān)。本研究中VDR基因BsmI、TaqI和FokI 3個(gè)位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在CHB組和對(duì)照組、CHB輕度組和中度組中的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而ApaI位點(diǎn)的基因型頻率分布在CHB組和對(duì)照組中的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CHB組的AC基因型頻率分布高于對(duì)照組，提示與ApaI CC基因型比較，攜帶AC基因型的兒童可能有更高的HBV感染風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.213，95%CI1.130～4.335)，但ApaI各基因型在不同嚴(yán)重程度CHB患兒中的頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明VDR基因SNPs可能與CHB患兒肝臟病變嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)。上述研究結(jié)果不一致的原因可能與種族差異、地域環(huán)境差異、受試人群生活方式特征，以及研究方法和樣本選擇的不同等有關(guān)。

HBV有多個(gè)基因型，我國(guó)以B基因型和C基因型為主[7]，HBV基因型與疾病進(jìn)展和干擾素治療應(yīng)答有關(guān)，HBV e抗原陽(yáng)性者B基因型對(duì)干擾素-α治療的應(yīng)答率高于C基因型[20]。本研究中HBV B基因型和C基因型的CHB患兒VDR基因 BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4個(gè)位點(diǎn)的基因型與等位基因頻率分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示VDR基因SNPs可能與HBV B基因型或C基因型的易感性無(wú)關(guān)。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，CHB患兒VDR基因 BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4個(gè)位點(diǎn)不同基因型間的血清25(OH)D水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明VDR基因SNPs在調(diào)控25(OH)D生物學(xué)功能的同時(shí)，可能并不影響血清中的25(OH)D水平，與相關(guān)研究一致[6]。本研究中與病例組比較，對(duì)照組兒童樣本量較小，存在一定的局限性，另外本次單中心研究未納入組織病理活檢診斷為重度CHB的患兒，可能導(dǎo)致研究結(jié)果不全面，有待進(jìn)一步的多中心擴(kuò)展研究與驗(yàn)證。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，VDR基因ApaI(rs7975232)位點(diǎn)多態(tài)性可能與兒童CHB易感性相關(guān)，攜帶AC基因型者發(fā)生HBV感染的危險(xiǎn)性增高；未發(fā)現(xiàn)VDR基因位點(diǎn)(BsmI、ApaI、TaqI、FokI)多態(tài)性與CHB患兒肝臟病變嚴(yán)重程度、HBV基因型及血清25(OH)D水平的相關(guān)性。