侯文博,焦慧慧,李亞欣,劉永亮,苗志國,張金洲

（河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

LPL（脂蛋白脂肪酶,Lipoprotein lipase）在調(diào)控脂蛋白運輸和脂肪沉積方面發(fā)揮重要作用,具有將毛細血管內(nèi)皮細胞表面血液循環(huán)乳糜微粒和極低密度脂蛋白所含的甘油三酯（Triglyceride,TG）水解為游離脂肪酸和作為脂蛋白攝取介導(dǎo)受體的雙重功能.從Hocquette 等[1]研究可知：LPL mRNA 水平與其活性正相關(guān).LPL 的活性決定脂肪沉積的程度,主要是通過控制肌肉和脂肪中TG 分配的數(shù)量來實現(xiàn),特別是在肌內(nèi)脂肪（Intramuscular fat,IMF）的合成和代謝進程中.王晶等[2]研究發(fā)現(xiàn),雞LPL 基因表達量和IMF 含量的發(fā)育性變化呈一致的正相關(guān).另有研究表明,豬14 號染色體上LPL 基因突變對背部脂肪沉積、背膘厚有顯著影響[3-5].脂肪沉積是影響肉質(zhì)重要的因素之一.皮下脂肪沉積主要影響胴體瘦肉率,IMF 含量與豬肉的嫩度、風(fēng)味、多汁性呈正相關(guān)[6-8].

VD3（維生素D3,Vitamin D3）屬于類固醇脂溶性維生素，在生物學(xué)方面具有促進細胞生長分化、機體繁殖免疫和調(diào)節(jié)礦物質(zhì)（鈣磷）吸收代謝的功能.仔豬VD 缺乏時,鈣磷吸收紊亂,進而引起骨骼鈣化.Norman 等[9]研究發(fā)現(xiàn),VDR 存在于許多和鈣磷穩(wěn)態(tài)無關(guān)的組織中,說明VD 可能有其他重要的生物學(xué)功能.目前大多數(shù)報道主要集中在日糧VD3水平對于斷奶仔豬的生長功能、免疫功能、抗炎癥功能的影響研究[10-12].但通過母體遺傳效應(yīng)改變仔豬脂肪代謝基因調(diào)控機制的研究鮮有報道.因此,通過開展母體不同VD3 水平對仔豬脂肪酸轉(zhuǎn)運基因LPL 表達量的影響研究, 從而探求母體VD3水平影響子代LPL 基因表達規(guī)律和機制,以期在以后的生產(chǎn)生活中為通過改善母體VD3水平調(diào)控仔豬脂肪沉積、滿足優(yōu)良豬肉品質(zhì)需求提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組

選取由洛陽市伊川縣新大牧業(yè)有限公司飼養(yǎng)的24 頭體質(zhì)量接近（144.6±2.3 kg）、健康的同期配種妊娠長白母豬,根據(jù)妊娠期間基礎(chǔ)日糧VD3水平隨機分為4 組,即對照組VD3-200 IU/kg、低水平VD3組-800 IU/kg、中等水平VD3組-3 200 IU/kg、高水平VD3組-6 400 IU/kg.泌乳期所有母豬基礎(chǔ)日糧VD3水平保持相同,斷奶后仔豬基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)成分保持一致.試驗期保證相同的豬舍環(huán)境,包括溫度、濕度、光照等.妊娠期、泌乳期母豬和仔豬各生長階段基礎(chǔ)飼糧配方參照2012 年NRC 配制.

1.2 采樣

待仔豬六月齡時,從各組中隨機選擇3 個個體,共12 個個體按照《生豬屠宰操作規(guī)程》（1998）屠宰.采集背最長肌、背脂樣品,一部分于-20 ℃保管,用于IMF 含量測定,剩余部分置于液氮中冷凍,然后移至-80 ℃儲存,用于總RNA 的提取研究.

1.3 IMF 含量測定

采用索氏浸提法測定IMF 含量.利用石油醚提取單個背最長肌樣品中的脂肪,每個樣品測定3 次,以3 次測定的平均值代表樣品的IMF 含量.

1.4 RT-PCR 相對定量測定

1.4.1 總RNA 的提取及cDNA 的合成 分別取黃豆粒大小背最長肌、背脂樣品置于研缽中,倒入適量液氮,依照RNAAiso Plus 說明書使用TRIzol 提取總RNA.利用超微分光光度計測定純度（D260nm/D280nm=1.8～2.0）.使用RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑構(gòu)建20 μL 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系.具體步驟：加入RNA 模板、RNase Free dH2O、5×gDNA Eraser Buffer（2.0 μL）、gDNA Eraser 42℃（1.0 μL）共10.0 μL后于PCR 儀42 ℃反應(yīng)2 min,再加入剩余試劑（10.0 μL）37 ℃反應(yīng)15 min.

1.4.2 引物設(shè)計與合成 依據(jù)GenBank 發(fā)布的LPL 基因序列,以豬的β-actin 基因作為內(nèi)參基因.利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物,由上海生工生物公司合成,引物序列信息見表1.

表1 引物序列信息Tab. 1 Primer sequence information

1.4.3 PCR 反應(yīng)與電泳分析 以β-actin 作為內(nèi)參基因,測定LPL 基因在背最長肌、背脂中相對表達量.RT-PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：cDNA 模板1 μL、上下游引物各0.5 μL、TaqDNA 聚合酶12.5 μL、ddH2O 10.5 μL.PCR 儀反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s,57.5 ℃（表1）退火30 s,72℃延伸30 s,共32 個循環(huán)；最后72℃延伸5 min.每個樣品設(shè)置3 個重復(fù).取21 μLPCR 產(chǎn)物,以EB 染色的瓊脂糖凝膠為載體在TAE 緩沖液中進行電泳.以目的基因LPL 與內(nèi)參基因β-actin PCR 產(chǎn)物灰度值之比表示LPL基因的相對表達量.

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

運用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件中的One-way ANOVA 對各組背最長肌肌內(nèi)脂肪含量、LPL 基因表達和背脂LPL 基因表達差異進行單因素分析,結(jié)果采用平均值±標(biāo)準差表示；對于不同VD3水平下背肌LPL基因表達量與IMF 含量雙變量,使用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件中的Bivariate Correlation 進行相關(guān)性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 背最長肌IMF 含量分析

由表2 可知,隨母體VD3水平的增加,背最長肌IMF 含量總體呈下降趨勢.對照組200 IU/kg IMF 含量顯著高于試驗組各水平（P＜0.05）；低水平試驗組800 IU/kgIMF 含量顯著高于高水平試驗組6 400 IU/kg（P＜0.05）.

表2 各組背最長肌IMF 含量Tab. 2 IMF content of the longissimus dorsi in each group

2.2 背最長肌LPL 基因mRNA 的表達差異及其與IMF 含量的相關(guān)性分析

由圖1 可知,仔豬背最長肌中LPL 基因mRNA 的表達隨母體VD3水平的增加,總體呈先略微升高再逐漸下降的趨勢.在低水平試驗組（800 IU/kg）時LPL 表達量達到峰值,顯著高于高水平試驗組（6 400 IU/kg）（P＜0.05）；對照組（200 IU/kg）LPL 表達量顯著高于高水平試驗組（6 400 IU/kg）（P＜0.05）.其余各組之間差異不顯著（P＞0.05）.

長白仔豬背最長肌LPL 基因表達量與IMF 含量的相關(guān)性分析表明：長白仔豬背最長肌LPL 基因mRNA 表達量與肌內(nèi)脂肪含量總體上呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為R=0.679（P＜0.05）.見表3.

圖1 母體不同VD3水平下仔豬背肌中LPL 基因的差異表達Fig. 1 Differential expression of LPL gene in the back muscle of piglets at different VD3 levels.

表3 背肌LPL 基因的表達與IMF 含量的相關(guān)性分析Tab. 3 Correlation Analysis of LPL gene expression and IMF content in dorsal muscle

2.3 背部脂肪LPL 基因mRNA 的表達差異分析

由圖2 可知,隨母體VD3水平的增加,仔豬背脂中LPL 基因mRNA 的表達呈先下降再逐漸上升的趨勢.LPL 基因在低水平試驗組（800 IU/kg）時表達量最低；在高水平試驗組（6 400 IU/kg）時LPL 表達量達到峰值,明顯高于低水平試驗組（800 IU/kg）（P＜0.05）；其余各組之間差異不顯著（P＞0.05）.

圖2 母體不同VD3水平下仔豬背脂中LPL 基因的差異表達Fig. 2 Differential expression of LPL gene in piglet back fat at different vitamin D3 levels

3 討論

早期研究表明,VD 在鈣穩(wěn)態(tài)和骨質(zhì)代謝方面起著不可替代的作用.近年來,也有研究發(fā)現(xiàn),VD 與肥胖、脂肪質(zhì)量和組織功能、糖尿病有關(guān)[13-15].VD3 化學(xué)名稱為膽鈣化醇,是迄今為止在動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的VD的唯一天然成分.VD3 主要來源是陽光照射下皮膚合成,也可通過日常飲食攝取,與受體蛋白結(jié)合后,依次在肝臟、腎臟內(nèi)經(jīng)過羥基化,最終形成具有生物活性的1,25（OH）2D3[13,16].有關(guān)研究發(fā)現(xiàn),VD 的分解代謝主要是在肝臟,所生成的25（OH）D3 是血液循環(huán)中VD 的主要存在形式,因此在臨床上以血清中25（OH）D3 濃度來評估VD 水平[17-18].關(guān)于血清25（OH）D3 研究表明,其濃度與體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、脂肪質(zhì)量呈負相關(guān)[19-21].

目前大多體外研究確定,VD3抑制3T3-L1 前脂肪細胞分化為成脂細胞,明顯抑制3T3-L1 成脂細胞沉積脂肪[22-23].相關(guān)研究表明,1,25（OH）2D3 可誘導(dǎo)3T3-L1 脂肪細胞LPL 脂解活性,使其mRNA 表達水平明顯提高,并且能夠促進脂肪動員,增強脂肪分解,減少脂肪積累[24-25].另有研究發(fā)現(xiàn),1,25（OH）2D3 通過劑量依賴抑制脂肪轉(zhuǎn)錄因子和脂肪生成晚期標(biāo)志物（LPL、FAS 和脂質(zhì)結(jié)合蛋白2）表達,抑制3T3-L1 前脂肪細胞分化和脂肪細胞生成脂肪[13,26].妊娠大鼠體內(nèi)研究表明,VD3抑制了脂肪生成相關(guān)基因的表達,脂肪組織的脂肪沉積率顯著降低[27].此外,VDR 作為VD 的受體同樣參與3T3-L1 前脂肪細胞分化過程,而且高度表達時也會抑制前脂肪細胞分化.但有體內(nèi)研究表明,VDR 可抑制脂肪分解基因（如激素敏感脂肪酶HSL）,抑制脂質(zhì)動員[28].由此可見,在脂肪沉積過程中,VD3及其受體對LPL 表達活性的影響可能與體內(nèi)外研究結(jié)構(gòu)層次、1,25（OH）2D3 劑量有關(guān).

脂肪積累過程主要包括前脂肪細胞分化、脂肪細胞增殖分裂、脂肪細胞體積增大.LPL 作為分化初期階段的標(biāo)志基因之一,其降解轉(zhuǎn)運外源性脂肪酸對促進脂肪細胞分化成熟有著重要的作用,最終直接影響脂肪沉積.張雄[29]對江香豬肌內(nèi)脂肪構(gòu)建預(yù)測模型研究表明：LPLmRNA 表達量與IMF 含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）.本研究通過控制長白妊娠母豬日糧VD3添加水平,發(fā)現(xiàn)六月齡仔豬背最長肌IMF 含量隨母體VD3水平增加呈下降趨勢,LPL mRNA 表達水平先略微上升后一直保持下降趨勢,二者呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）.因此,推測VD3極有可能通過抑制肌肉中LPL 基因活性,減少了由脂解血液循環(huán)中乳糜微粒和極低密度脂蛋白供應(yīng)肌肉的游離脂肪酸量,從而影響IMF 含量.另外,本研究還發(fā)現(xiàn)仔豬背脂LPLmRNA 隨母體VD3水平先下降后逐漸升高.LPL 基因測序研究表明,豬和鼠LPL 基因同源性高達88.7%.LPL 基因在脂肪和肌肉中的表達差異極大,以鼠為研究對象表達甚至是相悖的[30].由此推斷,本研究中LPL 基因在背最長肌與背脂中表達趨勢差異大,這可能與LPL 基因本身在肌肉和脂肪組織中作用機制不同有關(guān),也可能是VD3水平使肌肉和脂肪組織內(nèi)LPL 基因表達活性發(fā)生變化的閾值不同.本研究未測定仔豬其余部位肌肉、脂肪中LPL 基因mRNA 變化趨勢,因此探究母體VD3水平使仔豬肌肉和脂肪內(nèi)LPL 基因表達變化規(guī)律還需要進一步討論和總結(jié).

4 結(jié)論

長白仔豬背最長肌和背脂中LPL 基因表達趨勢不同,背最長肌中隨母體VD3水平的增加,LPL 基因mRNA 表達水平先上升后逐漸下降,在VD3水平為800IU/kg 時達到峰值,且顯著高于VD3水平為6400IU/kg表達水平（P＜0.05）；背脂中LPL 基因mRNA 表達水平先下降后上升,在VD3 水平6 400 IU/kg 時最高,顯著高于800 IU/kg 表達水平（P＜0.05）.背最長肌LPLmRNA 表達量與肌內(nèi)脂肪含量呈顯著正相關(guān)（R=0.679,P＜0.05）.本研究表明,通過母體遺傳效應(yīng),VD3水平升高顯著抑制了背最長肌中LPL 基因表達,進而IMF含量降低,脂肪沉積減少.