任 欣 沈 群

(北京工商大學食品與健康學院；北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心1，北京 100048)(中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院；植物蛋白與谷物加工北京市重點實驗室2，北京 100083)

腸道菌群是對寄居在人體腸道內(nèi)微生物群落的總稱，構(gòu)成復雜、細菌種類繁多，由500～1 000種不同種類的細菌構(gòu)成[1]，其細胞數(shù)量約為人體的10倍(1014)，基因數(shù)量約為人體的100倍[2]。腸道菌群是人體健康的基石[3]，近年來，腸道菌群已成為營養(yǎng)與健康等科學研究領(lǐng)域最值得關(guān)注的焦點之一，有關(guān)腸道微生物的研究正在逐漸改變?nèi)藗儗τ谏攀碃I養(yǎng)與疾病的傳統(tǒng)觀念。大量研究已經(jīng)證明，腸道微生物與2型糖尿病(T2D)等眾多復雜代謝性疾病密切相關(guān)[4]。過去50年，人類發(fā)現(xiàn)了糖尿病的眾多風險因素，而過去10年，科學家發(fā)現(xiàn)菌群可能是其中最重要的可變因素[5]。Larsen等[6]通過對比T2D患者與正常人腸道菌群的構(gòu)成和數(shù)量發(fā)現(xiàn)T2D患者體內(nèi)的厚壁菌門和梭菌屬所占比例顯著降低，擬桿菌門和變形菌門所占比例顯著升高。Qin等[4]通過對345份中國T2D患者及正常人群(對照)糞便樣本的分析表明，T2D患者的特征為中度腸道微生物失調(diào)，即一些常見的產(chǎn)丁酸鹽細菌豐度降低，各種條件致病菌以及其他負責還原硫酸鹽和抵抗氧化應激的微生物增加。

在能夠影響腸道菌群的所有因素中，飲食是最具有影響力且可以改變的因素[7]?；诖笠?guī)模人群的流行病學研究以及元分析發(fā)現(xiàn)，飲食對人類健康的保護作用主要歸因于水果、蔬菜和全谷物中的膳食纖維和生物活性物質(zhì)[8]。

小米是我國典型的全谷物食品。前期研究已經(jīng)證明小米及其制品的體外淀粉消化速率較慢，體內(nèi)血糖生成指數(shù)較低[9]，每日進食50 g小米制品可有效改善IGT患者的血糖代謝[10]。但進食小米是否會影響以及如何影響人體腸道菌群的組成和相對豐度目前尚不清楚。本研究將進一步測定分析IGT患者的腸道菌群在12周小米膳食干預前后的變化，探尋受小米膳食顯著影響的腸道微生物，并試圖分析腸道菌群在小米膳食干預改善IGT患者血糖代謝過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

東方亮小米、活性干酵母、泡打粉。DNA抽提試劑盒，PowerSoil-htp 96 Well Soil DNA Isolation Kit；瓊脂糖，biowestagArose；擴增試劑盒，GoTaq?Hot Start Colorless Master Mix；純化試劑盒，QIAquick?PCR Purification Kit。

1.2 儀器與設(shè)備

COBAS INTEGRA 800全自動生化分析儀，MultiskanTMGO酶標儀，SYSLG30-IV雙螺桿擠壓機，NanoDrop2000超微量分光光度計，DYY-6C電泳儀，ABI GeneAmp?9700型PCR儀，Illumina Miseq測序儀。

1.3 實驗設(shè)計

本實驗以前期進行的小米膳食臨床營養(yǎng)干預實驗為基礎(chǔ)，分別采集64名IGT受試者，其中男性27人, 占42.2%，女性37人, 占57.8%；平均年齡(56.0±0.88)歲，平均BMI為(25.98±0.44)，在12周干預前后的糞便樣本，進行后續(xù)腸道菌群的測定分析。小米膳食干預實驗的具體步驟參照文獻[10]：用50 g生小米制作而成的小米饅頭或小米餅代替受試者日常膳食中的部分常規(guī)主食(米飯或饅頭)，不強制要求食用時間，且對受試者其他日常飲食和生活習慣，包括體力活動情況等均不作干預。干預用小米饅頭和小米餅由項目組統(tǒng)一制作并真空包裝后發(fā)放給受試者。本研究得到北京大學生物醫(yī)學倫理委員會的批準(倫理審查批件號：IRB00001052-14023)，并在世界衛(wèi)生組織國際臨床試驗注冊平臺一級——中國臨床試驗注冊中心進行注冊(注冊號：ChiCTR-OON-16008603)。所有受試者在參與實驗前均詳細了解實驗內(nèi)容并簽署知情同意書。

1.4 糞便樣本的收集

分別在基線和末期階段收集受試者糞便樣本進行腸道菌群和短鏈脂肪酸的檢測。糞便樣本由受試者在規(guī)定時間內(nèi)按照工作小組提供的采集說明自行采集，采用內(nèi)含保存液的PSP管進行樣本收集，隨后置于-80 ℃冰箱保存待檢。

1.5 腸道菌群測定

采用16SrRNA進行腸道微生物測序。具體操作如下：基因組 DNA的提取。選用PowerSoil-htp 96 Well Soil DNA Isolation Kit試劑盒對樣本的基因組DNA進行提取，之后采用Onedrop儀器和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至0.5 ng/μL。PCR擴增。稀釋后的基因組DNA為模板；根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物以及GoTaq?Hot Start Colorless Master Mix進行PCR擴增，以確保擴增效率和準確性。PCR產(chǎn)物的混樣和純化。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，引物對應區(qū)域為16SrRNA的V4區(qū)，引物為515F-806R。PCR產(chǎn)物使用QIAquick?PCR Purification Kit試劑盒純化回收產(chǎn)物。上機測序與下機數(shù)據(jù)預處理。使用Pico Green熒光定量以及Agilent 2200 TapeStation電泳工作平臺檢測合格后，使用MiSeq進行上機測序。采用Illumina MiSeq測序平臺得到的下機數(shù)據(jù)存在一定的低質(zhì)量數(shù)據(jù)，會干擾分析的結(jié)果，因此在進一步分析前，需要對下機數(shù)據(jù)進行預處理。對高通量測序的原始數(shù)據(jù)首先根據(jù)Barcode的信息，將單個樣品數(shù)據(jù)拆分出來，取出引物序列，進行測序序列質(zhì)量控制；通過質(zhì)量檢查的序列，應用Ribosomal Database Project(RDP)Classifier 2.3進行序列比對，確定每條序列的分類等級(界、門、綱、目、科、屬)；最后應用Mothur進行OTUs(Operational Taxonomic Units，分類操作單元)劃分，以序列相似性97%為標準，將這些序列劃分為OTUs，并按照序列數(shù)量生成OTU豐度譜。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS軟件，畫圖使用GraphPad Prism。所有數(shù)據(jù)以mean±SEM的形式表示。小米膳食干預前后各指標的顯著性差異采用配對樣本t檢驗(符合正態(tài)分布的指標，LSD)或2相關(guān)樣本的wilcoxon秩和檢驗(不符合正態(tài)分布的指標)進行判斷。P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 小米膳食干預對IGT患者腸道菌群多樣性的影響

本次測定共檢出2 487種腸道微生物(以序列相似性97%為標準進行OTUs劃分)，所有樣本的稀釋性曲線均趨于平緩，Shannon多樣性曲線均達到平臺期，表明本次測序的數(shù)據(jù)量較為合理，測序深度足以覆蓋樣本中的絕大部分微生物，平均覆蓋度高達0.998，滿足微生物多樣性分析要求。物種多樣性分析結(jié)果見圖1，12周小米膳食干預結(jié)束后，IGT患者腸道可檢測到的OTUs種類與干預前相比顯著增加，腸道菌群ACE指數(shù)和Chao指數(shù)亦顯著增加，表明小米膳食干預可以顯著提高IGT患者腸道內(nèi)菌群的物種豐富度。

圖1 干預前后IGT患者腸道菌群多樣性變化

2.2 小米膳食干預及機體代謝指標對IGT患者腸道菌群的整體影響

從PCA主成分分析圖可以看出，經(jīng)過降維處理后，IGT受試者基線菌群可以與末期菌群較好分開，并且累積貢獻率達46.50%(圖2a)，再次證明12周小米膳食干預可以顯著影響受試者腸道微生物的組成及相對豐度。為了進一步明確空腹血糖及胰島素抵抗指數(shù)對受試者腸道菌群的影響，并避免小米膳食干預對結(jié)果的干擾，分別以空腹血糖6.1 mmol/L和胰島素抵抗指數(shù)3為界，對基線受試者的腸道菌群進行PCA分析，結(jié)果如圖2b～圖2c所示。無論以空腹血糖還是胰島素抵抗指數(shù)為分類標準，IGT受試者的腸道菌群均可以被明顯地分為2個不同的亞群，其累積貢獻率分別可達49.13%和51.07%，表明空腹血糖和胰島素抵抗指數(shù)均可以顯著改變糖耐量減低患者的腸道微生物相對豐度。類似的，另一項基于糖尿病前期和糖尿病患者的人群橫斷面研究結(jié)果同樣表明，IGT、復合性糖耐量受損及T2D患者的腸道菌群總體組成發(fā)生變化，基于胰島素抵抗，可顯著區(qū)分復合性糖耐量受損/T2D患者與血糖正常者[11]。人類腸道微生物的變化和宿主之間存在復雜的、疾病階段依賴的相互作用[12]。

圖2 PCA主成分分析圖

2.3 小米膳食干預對IGT患者腸道菌群在門水平的影響

本次腸道菌群測序結(jié)果顯示，厚壁菌門(圖3白色所示)是IGT患者腸道內(nèi)的第一優(yōu)勢菌，其平均相對豐度高達50%以上，位居第二位的是是擬桿菌門(圖3灰色所示)，二者之和占人體腸道菌群的90%，此消彼長，呈極顯著負相關(guān)(r=0.94，P=0.00)。其次是變形菌門、放線菌門、梭桿菌門、柔膜菌門(圖3)。經(jīng)過為期12周的小米膳食干預，IGT受試者厚壁菌門的相對豐度顯著增加(P=0.01)，擬桿菌門的相對豐度顯著減少(P=0.03)，厚壁菌門/擬桿菌門的比值由干預前的(2.15±0.26)增加到干預后的(3.30±0.46)(P=0.01)。Lee等[13]發(fā)現(xiàn)低亞油酸飲食在改善糖尿病肥胖大鼠的代謝反應的同時，提高了厚壁菌門/擬桿菌門的比值，與本研究結(jié)果一致。但Li等[14]發(fā)現(xiàn)小米在改善肥胖小鼠血脂代謝的同時，降低了厚壁菌門/擬桿菌門的比值。作為人類腸道菌群最重要的兩個門，厚壁菌門/擬桿菌門這一指標經(jīng)常出現(xiàn)在各有關(guān)腸道菌群的研究報告中，但結(jié)果不一，甚至經(jīng)常出現(xiàn)相反的結(jié)果[5, 15, 16]。與正常人群相比，Larsen等[17]發(fā)現(xiàn)T2D患者腸道內(nèi)厚壁菌門/擬桿菌門顯著下降，但Zhao等[18]卻發(fā)現(xiàn)這一指標在T2D患者中顯著上升。據(jù)一項匯總了13項病例對照研究結(jié)果的研究報道，3項研究結(jié)果表明厚壁菌門/擬桿菌門與T2D負相關(guān)，即T2D患者腸道內(nèi)厚壁菌門/擬桿菌門顯著下降；4項為正相關(guān)，其余6項為無關(guān)[5]。研究人員在肥胖患者中同樣發(fā)現(xiàn)了這一指標的矛盾存在[15]。

圖3 小米膳食干預對腸道菌群門水平相對豐度的影響

2.4 小米膳食干預對IGT患者腸道菌群在綱目科水平的影響

由圖4可知，從綱水平而言，糖耐量減低患者的腸道菌群主要由梭菌綱、擬桿菌綱、Negativicutes、γ-變形菌綱、桿菌綱和放線菌綱等組成，并以梭菌綱為優(yōu)勢菌，其相對豐度達50%以上，其次是擬桿菌綱，相對豐度為33%左右。12周小米膳食干預可以顯著提高受試者腸道內(nèi)梭菌綱和桿菌綱的相對豐度，顯著降低擬桿菌綱的相對豐度。從目水平而言，糖耐量減低患者的腸道菌群主要由梭菌目、擬桿菌目、Selenomonadales、腸桿菌目、乳桿菌目、雙歧桿菌目和梭桿菌目等組成，并以梭菌目和擬桿菌目為優(yōu)勢菌，相對豐度分別為54.1%和31.8%，12周小米膳食干預后，僅梭菌目顯著增加，擬桿菌目相對豐度雖有降低但不顯著。從科水平而言，糖耐量減低患者的腸道菌群主要由瘤胃球菌科、擬桿菌科、毛螺旋菌科、普雷沃氏菌科、韋榮球菌科、腸桿菌科和乳桿菌科等組成，其中瘤胃球菌科、擬桿菌科和毛螺旋菌科占比較高，相對豐度分別為29.32%、21.92%和21.06%。經(jīng)12周小米膳食干預后，受試者腸道內(nèi)的瘤胃球菌科顯著增加，普雷沃氏菌科顯著減少。瘤胃球菌科屬于腸道內(nèi)有益菌，已有研究將其定義為健康老齡化即長壽的關(guān)鍵指示菌[19]。因此本研究瘤胃菌科相對豐度的顯著增加再次證明小米膳食使得糖耐量減低患者的腸道菌群朝著更為健康有利的方向發(fā)展。

圖4 小米膳食干預對腸道菌群綱、目、科水平相對豐度的影響

2.5 小米膳食干預對IGT患者腸道菌群在屬水平的影響

從屬水平而言，糖耐量減低患者的腸道菌群主要由擬桿菌屬、柔嫩梭菌、未分類毛螺菌科、普氏菌屬、未分類瘤胃菌科、瘤胃球菌屬和毛螺菌屬等組成，具體相對豐度如圖5所示。Arumugam等根據(jù)擬桿菌屬、普氏菌屬和瘤胃球菌屬相對豐度的不同，將人類腸道菌群分為三種菌型[20]，本研究受試者均屬于以擬桿菌屬為優(yōu)勢菌的B型。

注：*代表未分類，右上角小圖為干預前后柔嫩梭菌屬的相對豐度。

柔嫩梭菌屬為糖耐量減低受試者腸道內(nèi)的第二優(yōu)勢菌，經(jīng)過為期12周的小米膳食干預后，其相對豐度由干預前的14.42%增加為干預后的19.99%，呈極顯著差異。柔嫩梭菌屬于厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目、瘤胃球菌科。體外培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)柔嫩梭菌能夠發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生少量的甲酸、D-乳酸以及大量的丁酸[21]。丁酸在維持腸道健康和發(fā)揮腸道功能方面占有重要地位，有關(guān)丁酸阻止病原菌入侵、維持免疫系統(tǒng)正常功能以及減緩癌癥進程等多種生理功能相繼被報道[22]。體內(nèi)研究同樣發(fā)現(xiàn)柔嫩梭菌屬是人體腸道內(nèi)的關(guān)鍵性功能菌，與宿主多條代謝途徑相關(guān)[23]。多項研究指出，腸道易激綜合癥[24]、潰瘍性結(jié)腸炎[25]、肥胖[26]、乳糜瀉[27]等患者腸道內(nèi)柔嫩梭菌的相對豐度均顯著低于健康者。Ramirez-Farias等[28]發(fā)現(xiàn)益生元菊粉能夠顯著增加腸道內(nèi)柔嫩梭菌的豐度，Sokol等[29]通過體內(nèi)外實驗證實柔嫩梭菌屬具有抗炎功效，并且能夠降低克羅恩病患者術(shù)后復發(fā)的幾率，Munukka[30]發(fā)現(xiàn)與高脂飲食對照小鼠相比，高脂飲食+口服柔嫩梭菌群可改善小鼠的肝臟健康并減少脂肪組織炎癥。柔嫩梭菌已成為眾多研究者公認的大有可為的二代益生菌[31]。據(jù)此推測，小米膳食可能通過增加菌群多樣性、改變IGT患者腸道菌群組成，尤其是增加柔嫩梭菌的相對豐度來實現(xiàn)降低血糖的功效。

3 結(jié)論

對比12周小米膳食干預前后IGT患者腸道微生物的組成和相對豐度，結(jié)果表明，小米膳食干預可顯著改變IGT患者的腸道菌群，顯著提高菌群多樣性、厚壁菌門/擬桿菌門比值和柔嫩梭菌屬的相對豐度。據(jù)此推測，小米膳食干預可通過改變IGT患者腸道菌群的組成和相對豐度來改善機體血糖代謝。