林松榮，張 磊，羅金現(xiàn)，秦克旺

(1.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510317；2.廣東省第二人民醫(yī)院，廣東 廣州 510317)

甲狀腺癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，盡管相對(duì)少見(jiàn)，但是一些流行病學(xué)研究[1]表明，其發(fā)病率在過(guò)去幾十年中仍逐漸增加，其原因可能與頸部超聲等成像技術(shù)的改進(jìn)和廣泛應(yīng)用有關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)DNA甲基化是調(diào)節(jié)甲狀腺癌進(jìn)展的重要因素。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化的DNA甲基化是重要的表觀遺傳修飾之一，在控制基因表達(dá)和維持基因組結(jié)構(gòu)上扮演著關(guān)鍵角色。異常DNA甲基化通常發(fā)生在轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子區(qū)域，主要通過(guò)高甲基化或低甲基化導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。DNA高甲基化表示甲基化的獲得，常常發(fā)生在抑癌基因上，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄的抑制和表達(dá)的下降；而DNA低甲基化則表示甲基化的缺乏，可激活原癌基因并影響染色體的穩(wěn)定性。DNA甲基化是人類腫瘤早期分子變化的表征和反映，這預(yù)示著對(duì)其的開(kāi)發(fā)研究有望提供一種早期識(shí)別和預(yù)防腫瘤的新方法。

1 甲狀腺癌中抑癌基因甲基化

與其他腫瘤一樣，異常甲基化導(dǎo)致腫瘤抑制基因的不適當(dāng)沉默，在甲狀腺癌中廣泛存在。這些抑癌基因包括ARAS相關(guān)區(qū)域家族基因1A(RASSF1A)、第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(PTEN)、組織金屬蛋白酶抑制劑3(TIMP3)、死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)、維甲酸受體β2(RARβ2)、上皮鈣黏附素(ECAD)、MutL同源基因1(MLH1)、p16及共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因(ATM)等。通常這些基因具有良好的抑癌作用，但是異常高甲基化使得上述基因的表達(dá)降低，繼而促進(jìn)了甲狀腺癌的發(fā)生與發(fā)展。

1.1 RASSF1A RASSF1A是最常被描述的抑癌基因之一，在許多腫瘤中可以觀察到它的失活。RASSF1A影響多種細(xì)胞過(guò)程，包括參與基因組穩(wěn)定性維護(hù)、微管動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等，啟動(dòng)子高甲基化使得上述功能丟失，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。Brown等[2]的研究顯示，在甲狀腺濾泡性增生(FTH)中，RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化及其導(dǎo)致的基因表達(dá)沉默經(jīng)常發(fā)生，推測(cè)RASSF1A可能在甲狀腺腫瘤形成的早期發(fā)生甲基化，并有助于FTH向甲狀腺腺瘤(FA)和甲狀腺癌演變。Kunstman等[3]報(bào)道，甲狀腺乳頭狀癌(PTC)中RASSF1A平均高甲基化水平是正常甲狀腺組織的4.2倍，且RASSF1A甲基化與PTC的多灶性明顯相關(guān)，但與囊外侵襲呈負(fù)相關(guān)。Stephen等[4]研究發(fā)現(xiàn)，Classic型FTC和Hurthle型FTC間RASSF1A甲基化程度差異明顯，Classic型FTC的RASSF1A甲基化水平較高，提示RASSF1A甲基化程度可作為區(qū)分這兩種FTC亞型的分子標(biāo)記。

1.2 PTEN PTEN的表達(dá)產(chǎn)物被認(rèn)為是一種脂質(zhì)和蛋白質(zhì)雙重磷酸酶，后者通過(guò)脂質(zhì)磷酸酶活性負(fù)向調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路而發(fā)揮抑癌作用。在甲狀腺癌中，PTEN受抑制的頻率高于突變或缺失的頻率，很可能是基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化引起其表達(dá)抑制[5]。Hou等[6]研究了良性甲狀腺腺瘤、FTC和甲狀腺未分化癌(ATC)中PI3K/AKT通路基因改變與PTEN甲基化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PTEN甲基化程度隨著腫瘤惡性程度的升高而增加，同時(shí)PTEN異常甲基化增強(qiáng)了PI3K/AKT通路的信號(hào)傳遞，后兩者的相互作用可能促進(jìn)了甲狀腺腫瘤的發(fā)展。Alvarez-Nunez等[5]研究顯示，F(xiàn)A和FTC中PTEN甲基化發(fā)生率分別為83%和85%，PTEN高甲基化可能在甲狀腺腫瘤(尤其是濾泡性腫瘤)的發(fā)生中起作用。

1.3 TIMP3 TIMP3是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的內(nèi)源性抑制劑，與MMPs結(jié)合能有效抑制后者活性，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤增殖、抑制血管生成和轉(zhuǎn)移而發(fā)揮抑癌作用。TIMP3啟動(dòng)子是一個(gè)經(jīng)常被靶向的甲基化位點(diǎn)，其高甲基化所致表達(dá)沉默在多種腫瘤中具有致癌性[7]。Hu等[8]研究顯示，PTC中TIMP3甲基化與腫瘤的腺外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和多灶性密切相關(guān)。

1.4 DAPK DAPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過(guò)調(diào)節(jié)不同的信號(hào)事件發(fā)揮作用，包括細(xì)胞凋亡、自噬和膜起泡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡為其基本功能。DAPK在包括甲狀腺癌的多種癌癥中處于失活狀態(tài)，很大程度上歸因于基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化。在Hu等[8]的研究中，PTC中DAPK啟動(dòng)子甲基化率為34%(78/231)，且DAPK甲基化與腫瘤的多灶性和大小有關(guān)。

1.5 RARβ2維甲酸受體(RARs)是類固醇激素受體超家族成員，通過(guò)與維甲酸類物質(zhì)相互作用而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞生成、分化、凋亡以及抑制多種組織癌變的作用。目前大多數(shù)研究聚集在RARβ2。RARβ2在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中表達(dá)減少，部分研究認(rèn)為是由于其基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化導(dǎo)致表觀遺傳沉默。黃鈾新等[9]對(duì)循環(huán)腫瘤DNA的研究表明，RARβ2甲基化率在甲狀腺癌組中明顯高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)組，且與甲狀腺癌臨床分期相關(guān)，同時(shí)研究結(jié)果提示RARβ2異常甲基化與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Kiseljak-Vassiliades等[10]研究證實(shí)，在PTC中TIMP3、SLC5A8及DAPK甲基化與吸煙僅有關(guān)聯(lián)趨勢(shì)，而RARβ2甲基化與吸煙有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)，但是對(duì)于后兩者的相互作用如何促進(jìn)PTC發(fā)生仍有待研究。

1.6 ECAD ECAD是經(jīng)典的腫瘤抑制因子，其編碼產(chǎn)物是一種黏附蛋白，在維持細(xì)胞黏附和上皮細(xì)胞表型方面發(fā)揮重要作用。ECAD表達(dá)丟失主要發(fā)生在表觀遺傳學(xué)水平，并且與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[11]。Jensen等[12]報(bào)道，PTC中ECAD甲基化率為39.3%(26/66)，并與甲狀腺外侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，同時(shí)該研究提示表觀遺傳機(jī)制和腫瘤壞死因子(TNF)誘導(dǎo)的信號(hào)通路各自獨(dú)立地調(diào)控ECAD的表達(dá)和定位，這些機(jī)制既促進(jìn)了甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲性，也可能在原發(fā)腫瘤中誘導(dǎo)上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤中促使間質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮重要作用。

1.7 MLH1 MLH1是錯(cuò)配修復(fù)基因之一，其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是DNA錯(cuò)配修復(fù)通路的組成部分，可在復(fù)制過(guò)程中有效地替換錯(cuò)配堿基，防止DNA損傷的累積。MLH1甲基化常常先于胃癌、肺癌和乳腺癌等的惡性增殖出現(xiàn)，因此其甲基化檢測(cè)可用于腫瘤發(fā)生的預(yù)測(cè)[13]。陸曉筱等[14]研究發(fā)現(xiàn)，MLH1基因啟動(dòng)子甲基化與PTC的大小、多灶性、腺外侵犯、T分期和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)，該基因的甲基化檢測(cè)有望成為PTC早期篩查和手術(shù)評(píng)估的指標(biāo)。Santos等[15]研究指出，在PTC、FTC和良性甲狀腺病變中，MLH1甲基化率分別為44%、33%和64%，并且MLH1表達(dá)降低與BRAF V600E突變、RET/PTC重排和轉(zhuǎn)換(IDH1和NRAS)有關(guān)。

1.8 p16 P16基因又稱多腫瘤抑制基因(MTS1)，其編碼產(chǎn)物是一種細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過(guò)與CDK4或CDK6結(jié)合，抑制CDK4或CDK6與細(xì)胞周期蛋白D之間復(fù)合物的形成，阻斷Rb蛋白磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期。p16在PTC中表達(dá)失調(diào)很少通過(guò)突變引起，已有的研究表明CpG島甲基化是p16失活的重要因素。Wang等[16]研究顯示，p16在PTC中的甲基化率為27%(20/74)，并與腫瘤TNM分期、高AMES(年齡、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腺外浸潤(rùn)、大小)及轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，認(rèn)為p16甲基化與PTC生物學(xué)轉(zhuǎn)移特性和組織學(xué)特征相關(guān)。戴亞麗等[17]研究指出，PTC中p16的甲基化率為54%(27/50)，且該基因甲基化與PTC的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。

1.9 ATM ATM在維持基因組穩(wěn)定性和提高細(xì)胞生存率方面具有重要作用，其編碼的蛋白質(zhì)能夠激活不同的效應(yīng)底物，參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA雙鏈修復(fù)以及細(xì)胞凋亡等過(guò)程。Brait等[18]研究顯示，ATM在正常甲狀腺組織、良性甲狀腺腺瘤和甲狀腺癌中的甲基化頻率分別為80%、53%和71%。

2 甲狀腺癌中原癌基因與甲基化

2.1 BRAF與DNA甲基化 BRAF突變是PTC中最常見(jiàn)的遺傳事件，其參與甲狀腺癌發(fā)生的主要信號(hào)途徑是RAS/BRAF/MEK/ERK通路。BRAF突變通常導(dǎo)致PTC具有侵襲性的臨床病理特征和更差的預(yù)后。目前的一些研究認(rèn)為甲狀腺癌中BRAF突變與腫瘤抑制基因甲基化關(guān)系密切。Hu等[8]研究了PTC中抑癌基因甲基化與腫瘤臨床病理特征及BRAF突變的關(guān)系，結(jié)果顯示TIMP3、SLC5A8、RARβ2及DAPK的甲基化與PTC的一些侵襲性特征和BRAF突變有關(guān)，并推測(cè)上述抑癌基因的甲基化可能是BRAF突變促進(jìn)PTC發(fā)生及侵襲性形成的重要環(huán)節(jié)。Botezatu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在BRAF突變陽(yáng)性的甲狀腺癌樣本中抑癌基因TIMP3、RARB、MGMT及NEUROG1的甲基化值較高，表明BRAF突變與這些基因甲基化顯著相關(guān)。

另外有研究分析了BRAF突變和甲狀腺癌DNA整體低甲基化的關(guān)系(Alu重復(fù)序列整體低甲基化作為DNA整體低甲基化的替代標(biāo)記)，發(fā)現(xiàn)在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的分化型甲狀腺癌(DTC)中，伴有BRAF突變的腫瘤Alu低甲基化增加，表明BRAF突變與DNA整體低甲基化相關(guān)，同時(shí)BRAF突變與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性DTC相關(guān)，但與低風(fēng)險(xiǎn)DTC無(wú)關(guān)[20]。

2.2 其他原癌基因與DNA甲基化 腫瘤中原癌基因的甲基化形式通常為低甲基化，這在包括甲狀腺癌的大多數(shù)腫瘤中已有報(bào)道。Rodríguez等[21]利用DNA甲基化陣列對(duì)甲狀腺癌異常DNA甲基化的整體模式進(jìn)行確定時(shí)，在非分化型甲狀腺癌中發(fā)現(xiàn)四個(gè)潛在的原癌基因(INSL4、DPPA2、TCL1B和NOTCH4)經(jīng)常受到低甲基化的調(diào)節(jié)。

3 甲狀腺癌中甲狀腺特異性基因甲基化

甲狀腺特異性基因主要包括促甲狀腺激素受體(TSHR)、鈉-碘轉(zhuǎn)運(yùn)體(NIS)、甲狀腺球蛋白(TG)和甲狀腺過(guò)氧化物酶(TPO)基因，這些基因在甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞中特異表達(dá)，在吸收、濃縮和利用碘方面起重要作用。甲狀腺特異性基因在甲狀腺癌中的表達(dá)經(jīng)常降低，雖然這些基因沉默的具體機(jī)制還不清楚，但是異常的DNA甲基化被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵原因。Khan等[22]研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌患者中TSHR基因甲基化率為25%(15/60)，其中伴有BRAF V600E突變的患者中TSHR甲基化率為73.3%(11/15)，說(shuō)明BRAF V600E突變與TSHR甲基化有明顯相關(guān)性，同時(shí)研究認(rèn)為針對(duì)BRAF/MEK/MAP激酶途徑為靶點(diǎn)的治療可能是恢復(fù)甲狀腺特異性基因表達(dá)的有效方法。Galrao等[23]在研究中發(fā)現(xiàn)了一種新的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子，即NIS遠(yuǎn)端增強(qiáng)子，可通過(guò)DNA高甲基化使得甲狀腺腫瘤中DNA表達(dá)降低，這可能是腫瘤發(fā)生的早期事件。TSHR及NIS的表達(dá)在甲狀腺癌中經(jīng)常丟失，引起碘吸收降低，最終導(dǎo)致甲狀腺癌放射性碘治療的失敗。

4 DNA甲基化與甲狀腺癌診治

4.1 甲狀腺癌診斷 隨著對(duì)DNA甲基化認(rèn)識(shí)的不斷深入，利用DNA甲基化作為甲狀腺癌早期診斷標(biāo)志物的想法已不新鮮。通過(guò)檢測(cè)這些DNA甲基化標(biāo)記物，人們的目標(biāo)是早期診斷甲狀腺癌，并從分子水平上區(qū)分甲狀腺癌亞型和甲狀腺良性結(jié)節(jié)，減少甲狀腺癌的過(guò)度診斷和手術(shù)。一項(xiàng)薈萃分析[24]顯示，RASSF1A啟動(dòng)子甲基化與甲狀腺癌的易感性和無(wú)病生存率密切相關(guān)，對(duì)RASSF1A甲基化水平的檢測(cè)可用于甲狀腺癌的臨床診斷。Stephen等[25]應(yīng)用甲基化定量PCR(QMSP)技術(shù)對(duì)甲狀腺病變石蠟包埋組織(FFPE)中21個(gè)候選基因的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)進(jìn)行單獨(dú)和組合分析，結(jié)果表明RASSF1A+TPO結(jié)合TPO+UCHL1的甲基化聯(lián)合檢測(cè)有助于鑒別FTC，RASSF1A+TPO甲基化組合有助于鑒別FA，TSHR甲基化檢測(cè)可用于鑒別PTC。雖然單個(gè)基因甲基化檢測(cè)的研究經(jīng)常報(bào)道，但有些研究認(rèn)為多個(gè)基因甲基化的聯(lián)合檢測(cè)更有利于提高標(biāo)志物的靈敏度及特異度，增加甲狀腺癌的診斷價(jià)值。

4.2 甲狀腺癌治療 鑒于甲狀腺癌中相關(guān)基因高甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)下調(diào)，使用改善這一變化的藥物誘導(dǎo)沉默的基因重新表達(dá)是當(dāng)前的一個(gè)研究方向。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑是最早被認(rèn)可的表觀遺傳藥物之一，在某些甲狀腺癌的治療試驗(yàn)已經(jīng)得到了報(bào)道。研究[26]發(fā)現(xiàn)，在PTC細(xì)胞中DNMT3A基因存在甲基化，通過(guò)去甲基化劑地西他濱處理后DNMT3A基因的表達(dá)得到了恢復(fù)。Vitale等[27]將地西他濱與依維莫司同時(shí)用于治療甲狀腺髓樣癌(MTC)細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥明顯提高了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，這為MTC和其他神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的治療開(kāi)辟了一個(gè)新的方案。一項(xiàng)Ⅱ期科學(xué)試驗(yàn)研究了地西他濱能否恢復(fù)轉(zhuǎn)移性DTC對(duì)131I的攝取，結(jié)果顯示在使用地西他濱后，患者體內(nèi)轉(zhuǎn)移性DTC病灶的131I攝取恢復(fù)，但該試驗(yàn)同時(shí)存在的副作用不容忽視。已有的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，去甲基化藥物在腫瘤細(xì)胞系中的應(yīng)用獲得了有希望的結(jié)果，但是它們?cè)谂R床試驗(yàn)中單獨(dú)應(yīng)用時(shí)則沒(méi)有成功的案例，盡管如此，一些證據(jù)認(rèn)為它們與其他藥物的聯(lián)合使用可能是一種潛在有用的治療方法[28]。

5 結(jié) 語(yǔ)

表觀遺傳修飾，特別是DNA甲基化，在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用已經(jīng)逐漸清晰。許多研究闡明了DNA甲基化作為新的分子標(biāo)記物在臨床應(yīng)用方面的潛力，DNA甲基化標(biāo)記穩(wěn)定，易在組織或體液中檢測(cè)，對(duì)甲狀腺癌的早期診斷、預(yù)后和治療效果的預(yù)測(cè)具有重大價(jià)值。在治療方面，根據(jù)DNA甲基化所開(kāi)發(fā)的藥物尚未能證明在甲狀腺癌治療中的有效性。由于DNA甲基化在甲狀腺癌基礎(chǔ)科學(xué)研究上還有許多不足，因此將其轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用中仍有許多工作要做。