張 博 諶苗苗 冀萬杰 趙春山 李喜升 王鳳成

(遼寧省蠶業(yè)科學研究所，國家蠶桑改良中心遼寧柞蠶分中心，遼寧省野蠶研究重點實驗室，遼寧鳳城 118100)

柞蠶核型多角體病毒是危害柞蠶的主要病原，在我國的遼寧、吉林、山東、黑龍江、內蒙古、河南等省每年均有不同程度的發(fā)生，在遼寧省嚴重時發(fā)病率可達50%以上，有的年份個別地區(qū)發(fā)病率竟高達80%以上。給廣大養(yǎng)蠶農戶造成很大的經(jīng)濟損失。尤其最近幾年，該病的發(fā)生呈加重趨勢[1-2]。因此，柞蠶品種對于ApNPV的抗性是評價品種生產(chǎn)性狀的一項重要指標。

熱激蛋白是在熱激條件下產(chǎn)生的一種特殊蛋白，此外其他外界刺激，如缺氧[3]、中毒[4]、缺乏能量[5]、病毒侵染[6]等，也能夠刺激機體產(chǎn)生熱激蛋白。它在進化上高度保守，且在生物體內具有重要的生理意義，參與熱耐受[7]、免疫調控、細胞凋亡、病毒感染等生理過程[8]。

有研究顯示，柞蠶21.4 KDa小熱激蛋白(Ap-sHSP21.4)在大腸桿菌、白僵菌和ApNPV感染時在柞蠶中腸和脂肪體中高量上調表達。干擾Ap-sHSP21.4基因的合成可導致防御素、多巴脫羧酸酶、溶酶菌等參與免疫調控基因的下調[9]。對5齡家蠶進行42 ℃、15 min短時熱激處理可提高家蠶對核型多角體病毒的抗性[10]。

本文將重點介紹高溫脅迫后柞蠶F1代稚蠶對ApNPV的抗性對比試驗，討論柞蠶品種熱激蛋白表達量差異與ApNPV抗性差異的關聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的4個柞蠶品種為方山黃、抗大、F、5204，是在2016年耐熱性特征研究中篩選出來的4個耐熱性比較強的品種，由遼寧省蠶業(yè)科學研究所提供。2017年7月，將制備好的上述4個品種的種卵自然溫度催青，待孵化出蠶進行試驗。

柞蠶核型多角體病毒(ApNPV)由遼寧省蠶業(yè)科學研究所柞蠶保護研究室采集留存和提純。

1.2 柞蠶核型多角體病毒(ApNPV)原液的制備及各濃度梯度的配制

將提純的柞蠶核型多角體病毒(ApNPV)原液以無菌水稀釋、勻漿后，血球計數(shù)板計算濃度為1.3×109p/mL的溶液作為病毒原液，保存?zhèn)溆?。?.3×109p/mL的溶液作為病毒原液為起始濃度，用滅菌水按10倍稀釋法依次逐級稀釋，即吸取1 mL 1.3×109p/mL的核型多角體病毒原液和9 mL滅菌水均勻混合得到1.3×108p/mL的病毒溶液，再吸取1 mL 1.3×108p/mL的核型多角體病毒原液和9 mL滅菌水均勻混合得到1.3×107p/mL的病毒溶液，以此類推，依次得到1.3×106p/mL、1.3×105p/mL、1.3×104p/mL、1.3×103p/mL共6個濃度的病毒溶液，本次采用1.3×103～1.3×107p/mL共5個濃度進行試驗。

1.3 試驗蠶的準備

將供試的4個柞蠶品種按每個品種取10個蛾的卵，攪拌均勻，然后每個品種各取6 g卵平均分成6份置于產(chǎn)卵袋中。用事先準備好的0.5%的氫氧化鈉溶液去掉卵表面的粘液，再放入甲醛-鹽酸混合溶液中進行卵面消毒，晾干后掛在消毒過的養(yǎng)蠶室內，待孵化前一天采用室內卵面添毒方法，把蠶卵用紗布包好浸泡在5個濃度梯度的病毒液中，對照組浸泡無菌水中，浸泡時間為2 min，晾干裝入養(yǎng)蠶袋(已消毒)中待第2天孵化。

1.4 調查方法

蠶卵孵化時，蟻蠶因咬食卵殼而感染核型多角體病毒。將養(yǎng)蠶袋內的蠶(健康且大小均勻)分裝在貼有品種名和病毒溶液濃度標簽的罐頭瓶(已消毒)中，每個品種5個濃度，每個濃度5次重復，每個品種每個濃度各設置一個對照組，每個瓶中飼養(yǎng)10頭蟻蠶。溫度25～26 ℃，相對濕度80%～85%，每日取新鮮遼東櫟葉喂食1次，并且除蠶沙。逐日記錄蠶的發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)病蠶死蠶及時記錄并剔除，以免造成交叉感染，對于疑似病蠶，必須經(jīng)過顯微鏡檢查確認，避免數(shù)據(jù)誤差過大，調查至二眠起結束[11]。

1.5 試驗數(shù)據(jù)處理

利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對4個柞蠶品種(方山黃、抗大、F、5204)抗病性的原始數(shù)據(jù)進行分析。

1)毒力回歸方程方差分析F值及其顯著水平。數(shù)量型數(shù)據(jù)毒力回歸方程診斷采用方差分析方法進行，這是數(shù)量型資料和計數(shù)資料在生物測定分析進行模型診斷方面的差異。

2)對四個品種進行幾率值分析。DPS系統(tǒng)采用致死劑量比率測定方法來檢驗各個品種在致死劑量方面的差異：當致死劑量比率的95%置信區(qū)間包含1，則各品種的某致死劑量之間的差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 供試柞蠶品種的ApNPV抗性分析

用1.3×103～1.3×107p/mL共5個濃度梯度的ApNPV溶液分別處理4個品種即將孵化的蠶卵后，調查孵化后各品種的發(fā)病率，結果見表1。從中可以看出，處理的病毒溶液濃度越高，參試品種蠶的發(fā)病率越高，各品種平均發(fā)病率為26.9 %，對ApNPV的感染抵抗性品種存在一定的差異，參試的4個品種中，方山黃的抵抗能力最強，其次是5204、抗大，F(xiàn)的抵抗能力最差。

表1 柞蠶對ApNPV感染抵抗能力調查

采用DPS分析軟件對結果進行相應的模型分析，結果見表2。4個柞蠶品種的死亡率和幾率值都是隨著劑量的增加而逐漸增大，符合ApNPV濃度增大死亡率增大的現(xiàn)象。分析結果顯示5204和方山黃稚蠶的抗ApNPV能力較強。但F與方山黃在1.3×103p/mL、1.3×104p/mL、1.3×105p/mL上出現(xiàn)了低濃度死亡率大的結果，需要后期再確定結果的合理性。

表2 不同劑量下4個柞蠶品種的死亡率和幾率值

4個柞蠶品種LD50與劑量對毒力的回歸方程分析結果見表3，方山黃的LD50值為10.4874，明顯好于其他品種，5204的結果較方山黃的結果稍低，也好于其他兩個品種，該結果與死亡率和幾率值的結果相同。說明方山黃和5204對ApNPV的抗性較強。通過對不同劑量下的4個品種進行毒力結果顯著性分析發(fā)現(xiàn)，品種F在5個劑量間的毒力結果表現(xiàn)出極顯著性差異P<0.01。

表3 四個柞蠶品種的劑量對毒力回歸曲線和毒液半數(shù)致死劑量

通過毒力回歸曲線圖1顯示：4個柞蠶品種中，方山黃的斜率較低，隨著劑量逐漸的增大并沒有表現(xiàn)出趨勢大幅度變化的現(xiàn)象，說明該品種對ApNPV有相對穩(wěn)定的抵抗性，且相對抵抗性強于其他品種。雖然F的結果在低劑量上出現(xiàn)死亡個數(shù)較多的情況，方山黃存在較高劑量間死亡個數(shù)少的現(xiàn)象，但是總體結果能夠看出相應的趨勢，品種間存在顯著性差異結果。

3 討 論

昆蟲在面臨溫度驟升和微生物脅迫時，會采取提高抗菌肽及熱激蛋白基因表達量的策略來應對這些脅迫[9]。本研究的4個柞蠶品種熱激處理后F1代的ApNPV抗性比較結果與前期熱激處理后各柞蠶品種2種熱激蛋白的表達量結果[12]趨勢基本一致，均為方山黃>5204>抗大>F?？赏茰y部分熱激蛋白家族成員參與柞蠶的ApNPV侵染后相應的免疫調控。即使昆蟲沒有免疫系統(tǒng)，但也可通過相應的一些脅迫過程達到對機體自身保護作用。后期需要進一步試驗劃分柞蠶熱激蛋白家族在ApNPV侵染后的免疫調控中所起作用的貢獻率。

在4個柞蠶品種中，方山黃和5204不僅在遭受高溫脅迫時表現(xiàn)出2種主要熱激蛋白基因的高量表達，而且在對熱激處理后F1代稚蠶添食ApNPV時表現(xiàn)出高抗性，因此推測這2個品種的耐高溫與抗ApNPV能力較好。柞蠶品種方山黃已審定并在山東省推廣應用多年，可將該品種作為柞蠶耐高溫品種選育試驗的對照品種。柞蠶品系5204在幼蟲具有典型標記表型形狀，若對該品種進行繼代熱激鍛煉，將更有可能培育出抗逆型柞蠶新品種。

此外，試驗選擇的柞蠶卵為熱激后的柞蠶F1代，取得的ApNPV抗性比較結果與熱激處理后熱激蛋白的表達量高低有一定相似性，需要進一步試驗確定熱激處理后各個柞蠶品種抗逆性是否進行了一定繼代效果，從而得到了兩個試驗結果的一致性。如果確定有抗逆性的繼代現(xiàn)象，可以通過逆境處理進行抗逆品種的選育與材料發(fā)掘的準備工作。