侯巧梅，孟敏

胰腺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因。雖然目前對(duì)胰腺癌的生物學(xué)認(rèn)識(shí)已經(jīng)取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，但目前還缺乏有效的篩查工具來(lái)檢測(cè)無(wú)癥狀的癌前病變和早期胰腺癌。此外，胰腺癌由于其深部位置和遲發(fā)癥狀經(jīng)常導(dǎo)致確診時(shí)已處于晚期，5 年總存活率僅約為5%。因此，迫切需要尋找新的潛在的生物標(biāo)志物，為準(zhǔn)確的預(yù)后預(yù)測(cè)和新療法的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。目前，糖鏈抗原19-9（CA19-9）是診斷胰腺癌的經(jīng)典指標(biāo)，對(duì)胰腺癌的診斷和預(yù)后具有良好的臨床價(jià)值。治療后CA19-9 水平升高表明預(yù)后不良，治療反應(yīng)差。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是大于200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA 的子集，其存在于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中但不編碼蛋白質(zhì)。雖然大多數(shù)lncRNAs 的功能和機(jī)制尚不清楚，但先前的證據(jù)表明，lncRNA 在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)lncRNA 的異常表達(dá)與許多疾病相關(guān)。最近的一項(xiàng)研究使用lncRNA 微陣列譜發(fā)現(xiàn)胰腺癌中的lncRNA 表達(dá)在癌組織和癌旁組織間存在顯著差異。此外，一些研究表明，lncRNAs 通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，遷移和侵襲參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。然而，關(guān)于lncRNA 在胰腺癌中作用的研究仍然十分有限。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)胰腺癌病人治療前血清中被轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子b 激活的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA-ATB）和CA19-9 的水平，探討lncRNA-ATB 對(duì)胰腺癌診斷和預(yù)后評(píng)估中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012 年4 月至2014 年7 月在安陽(yáng)市人民醫(yī)院肝膽外科接受手術(shù)治療的胰腺癌病人作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理學(xué)確診為胰腺癌；（2）入組前未接受術(shù)前化療、放療或靶向治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他部位腫瘤；（2）合并血液系統(tǒng)疾病或嚴(yán)重肝腎功能疾病。共有103例病人納入觀察組。其中男性68例、女性35 例；年齡范圍為40～75 歲，年齡（58.46±7.93）歲；胰頭癌66 例，胰腺體尾部癌37 例；腫瘤長(zhǎng)徑＜2 cm 者32 例，2～4 cm者58 例，＞4 cm 13 例。同時(shí)選取同時(shí)期住院的胰腺良性疾病病人150 例作為良性組，其中急性胰腺炎病人49例、慢性胰腺炎病人71例、胰腺良性占位病人30 例；男性105 例、女性45 例；年齡范圍為40～75 歲，年齡（57.88±8.04）歲。選取同時(shí)期健康體檢者150 例作為對(duì)照組，其中男性100 例、女性50 例；年齡范圍為45～65歲，年齡（57.13±6.35）歲。三組人群性別構(gòu)成和年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，所有病人都提供了書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 血清lncRNA-ATB 和CA19-9 水平檢測(cè)

抽取觀察組和良性組病人治療前、健康組體檢當(dāng)日清晨空腹靜脈血4 mL，3 000 r∕min 離心取上清液。采用電化學(xué)發(fā)光法（雅培I2000 化學(xué)發(fā)光儀）檢測(cè)血清CA19-9，正常參考值范圍＜39 U∕mL。采用TRIzol試劑盒（Invitogen，Carlsbad，CA，USA）提取總RNA。使用轉(zhuǎn)錄子第一鏈cDNA 合成試劑盒（德國(guó)羅氏）將總RNA（1 μg）用序列特異性引物或錨定寡聚（dT）18 引物和隨機(jī)六聚體引物逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)cDNA。采用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR），以β-肌動(dòng)蛋白水平作為正常化對(duì)照檢測(cè)lncRNA-ATB 的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火，延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)。用2法計(jì)算lncRNA-ATB 的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3 治療方法和隨訪

良性組病人接受常規(guī)治療。觀察組接受手術(shù)治療為主，放化療為輔的綜合治療方式者27例，接受術(shù)后化療者36例，接受術(shù)后放療聯(lián)合化療者40 例。采用電話結(jié)合門(mén)診復(fù)診的方式進(jìn)行隨訪，隨訪間隔為每3 個(gè)月隨訪1 次。隨訪截止日期為2019 年8 月1 日，失訪7 例?？傮w生存時(shí)間為第一次手術(shù)到胰腺癌相關(guān)死亡的時(shí)間（未發(fā)生死亡時(shí)間者為最后一次隨訪時(shí)間）。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

三組研究對(duì)象血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）和空腹血糖（GLU）均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），而三酰甘油（TG）和總膽固醇（TC）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 三組研究對(duì)象血清CA19-9及l(fā)ncRNA-ATB比較

觀察組lncRNA-ATB和CA19-9水平均顯著高于良性組和健康組（均P＜0.05），良性組lncRNA-ATB和CA19-9水平顯著高于健康組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 胰腺癌103例、胰腺良性疾病150例及健康體檢者150例一般資料比較

表3 胰腺癌103例、胰腺良性疾病150例及健康體檢者150例血清CA19-9及l(fā)ncRNA-ATB比較

2.3 血清

lncRNA-ATB

水平對(duì)胰腺癌的診斷效能

ROC曲線顯示，血清lncRNA-ATB、CA19-9以及兩者聯(lián)合的曲線下面積（AUC）分別為0.833（95%CI：0.793～0.868，P＜0.001）、0.765（95%CI：0.720～0.805，P＜0.001）、0.884（95%CI：0.849～0.914，P＜0.001）。其中，兩者聯(lián)合檢測(cè)與lncRNA-ATB 及CA19-9 的AUC差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。lncRNA-ATB與CA19-9 的AUC 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)lncRNA-ATB 截?cái)嘀禐?.85 時(shí)，lncRNA-ATB 胰腺癌的靈敏度為74.8%，特異性為79.0%。當(dāng)CA19-9 截?cái)嘀禐?4.04 U∕mL時(shí)，CA19-9診斷胰腺癌的靈敏度為39.8%，特異性為99.3%；而兩者聯(lián)合檢測(cè)的敏感性為79.6%，特異性84.7%。見(jiàn)圖1。

圖1 血清lncRNA-ATB、CA19-9以及兩者聯(lián)合檢測(cè)診斷胰腺癌96例的ROC曲線（失訪7例）

2.4 血清lncRNA-ATB 與CA19-9的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)分析顯示，lncRNA-ATB 與CA19-9呈顯著正相關(guān)（r＝0.307，P＜0.001）。見(jiàn)圖2。

2.5 血清lncRNA-ATB及CA19-9與胰腺癌病人預(yù)后的相關(guān)性分析

年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、血清lncRNA-ATB 相對(duì)表達(dá)量及血清CA19-9 納入COX 回歸模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較高TNM 分期、較高血清lncRNA-ATB 相對(duì)表達(dá)量及較高血清CA19-9 是影響胰腺癌病人術(shù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4及圖3。

圖2 胰腺癌103例中病人血清lncRNA-ATB與CA19-9的相關(guān)性分析

表4 胰腺癌96例多因素生存分析

圖3 血清lncRNA-ATB相對(duì)表達(dá)量與胰腺癌96例總體生存率的相關(guān)性（失訪7例）

3 討論

胰腺癌是全球最常見(jiàn)和最致命的癌癥之一。因此，尋找新的分子靶點(diǎn)對(duì)于胰腺癌的診斷、預(yù)后和治療具有重要意義。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們普遍認(rèn)為只有不到2%的人類(lèi)基因編碼蛋白質(zhì)，剩下的98%編碼非編碼RNA（ncRNAs）。ncRNAs 包括lncRNAs 和環(huán)狀RNAs，最初被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄的“噪音”或身體的“暗物質(zhì)”。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，lncRNAs在多種疾病，特別是惡性腫瘤中發(fā)揮著重要作用。

lncRNA-ATB 是位于chr14（q11.2）上的poly（A）-陰性的RNA。有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-ATB 在肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)并且與預(yù)后不良相關(guān)。此外，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)lncRNA-ATB 是胃癌的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物，參與結(jié)直腸癌的進(jìn)展和預(yù)后。同樣Shi等表明lncRNA-ATB 在乳腺癌病人的曲妥珠單抗耐藥SKBR-3細(xì)胞和曲妥珠單抗耐藥組織中顯著上調(diào)，并且可以促進(jìn)曲妥珠單抗耐藥和乳腺癌中的侵襲-轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)。然而，關(guān)于lncRNA-ATB 在胰腺癌病人中診斷和預(yù)后中的作用知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，血清lncRNA-ATB 在健康對(duì)照者、良性疾病病人和胰腺癌病人中表達(dá)逐漸增高，表明血清lncRNA-ATB可能是胰腺癌早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。ROC曲線分析顯示，當(dāng)lncRNA-ATB 的截?cái)嘀禐?.85，CA19-9 的截?cái)嘀禐?4.04 U∕mL 時(shí)，血清lncRNAATB、CA19-9以及兩者聯(lián)合診斷胰腺癌的AUC分別為0.833、0.765、0.884。與CA19-9 相比，血清lncRNA-ATB 診斷胰腺癌的AUC 顯著增加，表明血清lncRNA-ATB對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值優(yōu)于CA19-9。進(jìn)一步分析兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)可提高胰腺癌診斷的靈敏度和特異性，有助于提高診斷的準(zhǔn)確性。

已有研究證實(shí)lncRNA-ATB 表達(dá)上調(diào)的結(jié)直腸病人預(yù)后更差。Jang 等發(fā)現(xiàn)，lncRNA-ATB 表達(dá)上調(diào)是影響肝細(xì)胞癌病人術(shù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此外，lncRNA-ATB 在胃癌組織中的表達(dá)高于正常組織，其表達(dá)水平與胃癌病人術(shù)后總生存率顯著相關(guān)。這些證據(jù)提示lncRNA-ATB可能在胰腺癌預(yù)后判斷中具有一定的價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，血清lncRNA-ATB表達(dá)上調(diào)的胰腺癌病人生存時(shí)間明顯縮短，與在其他腫瘤中的研究結(jié)果一致。

目前，lncRNA-ATB 參與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不完全清晰。Sun 等研究發(fā)現(xiàn)，相較于癌旁組織，胰腺癌組織的lncRNA-ATB 相對(duì)表達(dá)量下降。我們的研究則表明，胰腺癌病人lncRNA-ATB表達(dá)水平均顯著高于良性組和健康組。值得說(shuō)明的是，與文獻(xiàn)報(bào)道相比，癌組織中l(wèi)ncRNA-ATB 表達(dá)水平仍要高于外周血表達(dá)水平，這可能是導(dǎo)致其釋放到循環(huán)的lncRNA-ATB 量還是要高于正常人的原因之一。此外，考慮到血液學(xué)生物標(biāo)志物的變異性，重復(fù)測(cè)量可能提供更為精確的lncRNA-ATB相對(duì)表達(dá)量。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)血清lncRNA-ATB 在胰腺癌病人中表達(dá)顯著上調(diào)，是胰腺癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。