鄧慧琳，楊婧，郭俐

類風濕關(guān)節(jié)炎（RA）影響全球約1%的人口健康，是世界各國普遍關(guān)注的健康問題和經(jīng)濟問題。研究顯示，α-硫辛酸在白細胞介素1β（IL-1β）誘導的軟骨細胞模型中發(fā)揮抗炎作用，對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞損傷具有保護作用，但其作用機制尚未完全闡明。近年來，微小RNA（miRNA）因其廣泛參與增殖、凋亡、炎癥和免疫等生物學和生物學過程而受到廣泛關(guān)注。例如，在Ⅱ型膠原誘導的RA 大鼠模型中，微小RNA-26a（miR-26a）的表達下調(diào)，上調(diào)miR-26a 可以減輕軟骨損傷，刺激細胞增殖，抑制軟骨細胞凋亡；微小RNA-23a（miR-23a）通過抑制核因子κB 激酶抑制劑（IKKα）表達抑制RA 軟骨細胞的炎癥反應。微小RNA-877-5p（miR-877-5p）是miRNA 家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)，在阿司匹林所致的人胃黏膜上皮細胞損傷中miR-877-5p 表達上調(diào)，抑制miR-877-5p 表達能夠減輕阿司匹林所致胃黏膜上皮細胞損傷。N-myc下游調(diào)節(jié)基因2（NDRG2）隸屬于NDRG 基因家族的成員，與骨發(fā)育密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α刺激人類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細胞可降低細胞中NDRG2 的蛋白水平。生物信息學分析顯示，NDRG2 是miR-877 的潛在靶基因，但α-硫辛酸和miR-877-5p 對IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷的影響，以及α-硫辛酸能否通過調(diào)控miR-877∕NDRG2 表達影響IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷目前還尚未可知。因此，本研究以IL-1β 誘導的軟骨細胞模擬RA 軟骨細胞損傷模型，分析α-硫辛酸對IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷的影響，初步探索其可能的分子機制，以期為α-硫辛酸在RA 的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

本研究于2019 年1 月至2019 年7月在南充市中心醫(yī)院風濕免疫科實驗室完成。8只（4周齡）SPF級雄性SD大鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；IL-1β 購自美國Sigma 公司；α-硫辛酸（CAS 號：1077-28-7；純度：BR，99%）購于上海源葉生物技術(shù)有限公司；杜爾伯格氏伊戈爾培養(yǎng)基（DMEM）和胎牛血清購于hyclone 公司；聚合酶鏈式反應（PCR）引物、miRNA模擬物陰性對照（miR-NC）、miR-877 模擬物（mimics）、miRNA 抑制物陰性對照（anti-miR-NC）、miR-877 抑制物（anti-miR-877）、NDRG2 野生型熒光素酶報告載體（WT-NDRG2）和NDRG2突變型熒光素酶報告載體（MUT-NDRG2）的構(gòu)建和測序由北京華大基因公司提供；Trizol 試劑、放射免疫沉淀測定（RIPA）裂解液、蛋白質(zhì)印跡（Western）封閉液、洗滌液均購于上海碧云天公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）∕碘化丙啶（PI）試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和干擾素γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購于武漢艾美捷科技有限公司；兔源B 細胞淋巴瘤-2蛋白（Bcl-2）單克隆抗體、兔源Bcl相關(guān)X蛋白（Bax）多克隆抗體、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔Ⅱ抗購于Abcam 公司；鼠源NDRG2 單克隆抗體和HRP 標記的羊抗鼠Ⅱ抗購于Santa Cruz公司。

1.2 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞分離及培養(yǎng)

取8只SPF級SD 大鼠，麻醉處死后，無菌條件刮取膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨，經(jīng)2 g∕L的Ⅱ型膠原酶消化處理4 h，分離軟骨細胞，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)。

1.3 細胞分組和處理

將同一批次生長良好的第二代關(guān)節(jié)軟骨細胞以2×10個∕孔接種到6 孔板，采用隨機數(shù)字表隨機分為Con 組（正常培養(yǎng)的軟骨細胞）、IL-1β組（用含10 ng∕mL的IL-1β的細胞培養(yǎng)液處理，構(gòu)建軟骨細胞損傷模型）、IL-1β+ALA-L組（用含10 ng∕mL 的IL-1β 和0.1 μmol∕L 的α-硫辛酸的細胞培養(yǎng)液處理）、IL-1β+ALA-M組（用含10 ng∕mL的IL-1β和1 μmol∕L的α-硫辛酸的細胞培養(yǎng)液處理）、IL-1β+ALA-H組（用含10 ng∕mL的IL-1β和10 μmol∕L的α-硫辛酸的細胞培養(yǎng)液處理）、IL-1β+anti-miRNC 組（轉(zhuǎn)染anti-miR-NC 后，用含10 ng∕mL 的IL-1β細胞培養(yǎng)液處理）、IL-1β+anti-miR-877組（轉(zhuǎn)染antimiR-877 后，用含10 ng∕mL 的IL-1β 細胞培養(yǎng)液處理）、IL-1β+pcDNA 組（轉(zhuǎn)染pcDNA 后，用含10 ng∕mL 的IL-1β 細胞培養(yǎng)液處理）和IL-1β+pcDNANDRG2 組（轉(zhuǎn)染pcDNA-NDRG2 后，用含10 ng∕mL的IL-1β細胞培養(yǎng)液處理）。干預處理時間為48 h。為進一步驗證α-硫辛酸是通過調(diào)控miR-877 ∕NDRG2 通路進而影響IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷，把miR-NC和miR-877 mimics分別轉(zhuǎn)染軟骨細胞后，用含10 ng∕mL 的IL-1β 和10 μmol∕L 的α-硫辛酸的細胞培養(yǎng)液干預處理，標記為IL-1β+ALA+miR-NC組和IL-1β+ALA+miR-877組，并進行后續(xù)分析。建模IL-1β濃度參考文獻［9］，α-硫辛酸濃度梯度設定參考文獻［10］。

1.4 qRT-PCR檢測

收集按照“1.3”進行相應干預處理的各組軟骨細胞，經(jīng)PBS 液漂洗后，利用Trizol 試劑于冰上提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，以cDNA 為模板進行qPCR 擴增。分別以U6 和GAPDH 為內(nèi)參基因，按照2法計算miR-877 和NDRG2 mRNA的相對表達量。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

收集按照“1.3”進行相應干預處理的各組細胞，用預冷的PBS 液洗滌細胞，離心棄去上清液，用1×Binding Buffer 重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×10個∕mL。取100 μL細胞懸液加入流式管內(nèi)，再加入5 μL 的Annexin V-FITC，混勻后，室溫避光孵育10 min，加入5 μL的PI染液，繼續(xù)孵育5 min 后，補加PBS 至500 μL，輕輕混勻后，進行上機檢測。

1.6 試劑盒檢測IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量

收集1.3進行相應干預處理的細胞培養(yǎng)液，按照ELISA試劑盒說明書操作步驟進行。

1.6.1 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達情況 收集按照“1.3”進行相應干預處理的各組細胞，經(jīng)PBS漂洗后，離心棄取上清液，用適量預冷的RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，按照1∶4比例加入5×蛋白上樣緩沖液，混勻后，煮沸3～5 min使細胞蛋白變性；取30 μg 蛋白樣品上樣進行SDSPAGE 凝膠電泳；電泳結(jié)束后，進行常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜（PVDF）；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，加入Western 封閉液室溫條件封閉1 h；Western洗滌液漂洗10 min，漂洗3次，加入已稀釋的NDRG2（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶500）以及GAPDH（1∶2 500）Ⅰ抗室溫孵育2 h；Western 洗滌液漂洗10 min，漂洗3 次；加入Ⅱ抗室溫孵育1 h；Western洗滌液再次洗膜后，進行ECL顯影；Image J軟件分析目的條帶灰度值（以GAPDH為內(nèi)參）。

1.6.2 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?利用生物信息軟件對miR-877 的靶基因進行預測，發(fā)現(xiàn)miR-877與NDRG2 能夠特異性結(jié)合，猜測NDRG2 是miR-877 的靶基因，并進行驗證。構(gòu)建野生型WTNDRG2和突變型MUT-NDRG2的NDRG2-3’UTR熒光素酶報告基因載體，利用Lipofectamine2000 將miR-877 mimics 和miR-NC 分 別 與WT-NDRG2 和MUT-NDRG21 共轉(zhuǎn)染軟骨細胞，培養(yǎng)48 h 后，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.7 統(tǒng)計學方法

利用SPSS 20.0學軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗進行分析，多組間比較采用單因素方差分析，之后組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響

與Con組比較，IL-1β組軟骨細胞促炎因子IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達降低，促凋亡蛋白Bax 的表達升高，細胞凋亡率升高；與IL-1β組比較，IL-1β+ALA-L組、IL-1β+ALA-M組和IL-1β+ALA-H 組軟骨細胞IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌降低，Bcl-2蛋白的表達升高，Bax蛋白的表達降低，細胞凋亡率降低，且隨著α-硫辛酸濃度的增加，細胞凋亡率逐步降低（P＜0.05）。見表1。以上結(jié)果表明，IL-1β可誘導軟骨細胞損傷，α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷具有保護作用。

表1 α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響∕

2.2 α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-877和NDRG2表達的影響

圖1 和表2 顯示，與Con 組比較，IL-1β 組軟骨細胞miR-877 的表達水平升高，NDRG2 mRNA 和NDRG2 蛋白的表達水平降低；與IL-1β 組比較，IL-1β+ALA-L 組、IL-1β+ALA-M 組和IL-1β+ALA-H 組軟骨細胞miR-877 的表達水平降低，NDRG2 mRNA和NDRG2蛋白的表達水平升高，且隨著α-硫辛酸濃度的增加，miR-877 的表達水平逐漸降低，NDRG2的表達水平逐漸升高（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，α-硫辛酸可抑制IL-1β 誘導的軟骨細胞中miR-877的表達，促進NDRG2表達。

圖1 NDRG2蛋白免疫印跡圖

表2 α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-877和NDRG2表達的影響∕

2.3 miR-877靶向調(diào)控NDRG2的表達

利用生物信息學軟件預測miR-877 靶基因顯示，miR-877 和NDRG2存在部分連續(xù)的結(jié)合位點，見圖2A。表3顯示，與miR-NC和WT-NDRG2共轉(zhuǎn)染組相比，miR-877和WT-NDRG2共轉(zhuǎn)染組軟骨細胞的熒光素酶活性降低（P＜0.05）；與miR-NC和MUT-NDRG2共轉(zhuǎn)染組相比，miR-877和MUT-NDRG2共轉(zhuǎn)染組軟骨細胞的熒光素酶活性變化無統(tǒng)計學意義。圖2B顯示，與miRNC組比較，miR-877組軟骨細胞中NDRG2蛋白表達量顯著降低［（0.23±0.03）比（0.65±0.06），P＜0.05］；與anti-miR-NC 組比較，anti-miR-877組軟骨細胞中NDRG2蛋白表達量顯著升高［（0.98±0.08）比（0.63±0.05），P＜0.05］。以上結(jié)果表明，NDRG2是miR-877的靶基因，miR-877可負性調(diào)控NDRG2的表達。

圖2 miR-877靶向調(diào)控NDRG2的表達：A為NDRG2的3’UTR序列中含有與miR-877互補的核苷酸序列；B為NDRG2蛋白免疫印跡（WT-NDRG2為野生型NDRG2熒光素酶報告載體，MUT-NDRG2為NDRG2為突變型NDRG2熒光素酶報告載體）

2.4 抑制miR-877 表達對IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷的影響

表4和圖3顯示，與Con組比較，IL-1β組軟骨細胞miR-877的表達水平升高，IL-6、TNF-α、IFN-γ 的分泌增加，Bcl-2 蛋白的表達水平降低，Bax蛋白的表達水平升高，細胞凋亡率增加；與IL-1β+anti-miR-NC 組相比，IL-1β+anti-miR-877 組軟骨細胞miR-877 的表達水平降低，IL-6、TNF-α、IFN-γ 的分泌減少，Bcl-2 蛋白的表達水平升高，Bax 蛋白的表達水平降低，細胞凋亡率降低（P＜0.05）。表明，抑制miR-877 表達可減輕IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷。

表3 雙熒光素酶報告實驗∕

圖3 凋亡相關(guān)蛋白表達

2.5 NDRG2過表達對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響

表5和圖4顯示，與Con組比較，IL-1β組軟骨細胞NDRG2 蛋白的表達水平降低，IL-6、TNF-α、IFN-γ 的分泌增加，Bcl-2 蛋白的表達水平降低，Bax蛋白的表達水平升高，細胞凋亡率增加；與IL-1β+pcDNA 組比較，IL-1β+pcDNA-NDRG2 組軟骨細胞NDRG2蛋白的表達水平升高，IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌減少，Bcl-2蛋白的表達水平升高，Bax蛋白的表達水平降低，細胞凋亡率減少（P＜0.05）。這表明，過表達NDRG2 可減輕IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷。

2.6 過表達miR-877 逆轉(zhuǎn)了α-硫辛酸對IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷的作用

表6 和圖5 顯示，與IL-1β 組比較，IL-1β+ALA 組軟骨細胞miR-877 的表達降低，NDRG2 蛋白的表達升高，IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌降低，Bcl-2蛋白的表達升高，Bax蛋白的表達降低，細胞凋亡率降低；與IL-1β+ALA+miR-NC組比較，L-1β+ALA+miR-877組軟骨細胞miR-877的表達升高，NDRG2蛋白的表達降低，IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌升高，Bcl-2蛋白的表達降低，Bax蛋白的表達升高，細胞凋亡率增加。表明，過表達miR-877能夠逆轉(zhuǎn)α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的保護作用。

表4 抑制miR-877表達對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響∕

表5 NDRG2過表達對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響∕

表6 miR-877過表達逆轉(zhuǎn)了α-硫辛酸（10 μmol∕L）對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的保護作用∕

圖4 NDRG2和凋亡相關(guān)蛋白免疫印跡圖

圖5 NDRG2和凋亡相關(guān)蛋白免疫印跡圖

3 討論

α-硫辛酸是一種天然存在的硫醇抗氧化劑，它不僅在糖尿病方面有廣泛的臨床應用，而且在心血管疾病和肝腎疾病中也有廣泛的應用。最近的研究表明，α-硫辛酸通過抑制IRF-1 的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)揮抗炎作用，從而對IL-1β 誘導的軟骨細胞具有保護作用；α-硫辛酸還可增加牛油果和大豆非皂化物對體外培養(yǎng)的軟骨細胞的抗炎活性。此外，α-硫辛酸還可抑制NF-κB通路活化，抑制TNF-α分泌，對碘乙酸鈉誘導的骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細胞具有保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，α-硫辛酸呈濃度依賴性地抑制IL-1β誘導的軟骨細胞IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌，抑制Bax 的表達，促進Bcl-2 的表達，抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡，發(fā)揮保護作用，這與Sun等的研究結(jié)論相一致。同時，本研究發(fā)現(xiàn)α-硫辛酸呈濃度依賴性地抑制IL-1β 誘導的軟骨細胞miR-877的表達，促進NDRG2 表達。此外，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蛍estern blot 檢測顯示，miR-877 可負性調(diào)控NDRG2 的表達。因此，推測α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞的保護作用可能與miR-877 ∕NDRG2分子軸的異常表達有關(guān)。

近年來，隨著對miRNA 研究的不斷深入，miRNA 與細胞凋亡、損傷的聯(lián)系越來越清晰。前人研究發(fā)現(xiàn)，miR-877參與多種細胞的凋亡過程，在X射線引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷中，miR-877 表達上調(diào)，miR-877 通過調(diào)控其靶基因參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的放射損傷過程；同時，miR-877表達上調(diào)還參與曲伐沙星等多種藥物誘導的肝損傷過程；此外，下調(diào)miR-877表達對阿司匹林所誘導的胃黏膜細胞損傷具有保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-877 表達可抑制IL-1β 誘導的軟骨細胞中IL-6、TNF-α、IFN-γ 的分泌，降低Bax 的表達，增加Bcl-2的表達，抑制細胞凋亡。提示抑制miR-877表達與α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的保護作用一致。

NDRG 基因家族包括NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4四個家族成員，是近年發(fā)現(xiàn)的一類細胞內(nèi)信號分子。NDRG2 基因定位于染色體14q11.2 位點，作為一種抑癌基因，NDRG2 基因的表達缺失與結(jié)腸癌、胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。同時，NDRG2 還可在應激條件下發(fā)生改變，影響細胞的生理和病理過程。在大鼠心肌缺血再灌注損傷中NDRG2 表達下調(diào)；在肺缺血再灌注損傷中，過表達NDRG2 可抑制炎性因子TNF-α、IL-6 表達，抑制病理組織的炎性改變。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達NDRG2 可抑制IL-1β 誘導的軟骨細胞炎性因子IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌，降低Bax的表達，增加Bcl-2的表達，抑制細胞凋亡。提示miR-877∕NDRG2分子軸參與對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的調(diào)控。為進一步驗證α-硫辛酸對調(diào)控miR-877∕NDRG2 分子軸對IL-1β誘導的軟骨細胞發(fā)揮保護作用，將miR-877轉(zhuǎn)染軟骨細胞，經(jīng)IL-1β 誘導和α-硫辛酸干預處理后，發(fā)現(xiàn)miR-877過表達可逆轉(zhuǎn)α-硫辛酸對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響。提示，α-硫辛酸通過調(diào)控miR-877∕NDRG2通路對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷具有保護作用，在RA 等炎癥相關(guān)關(guān)節(jié)疾病的預防和治療中具有科研前景。

綜上所述，α-硫辛酸通過減弱炎癥反應，抑制細胞凋亡，對IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷具有保護作用，其機制與調(diào)控miR-877∕NDRG2通路有關(guān)。本研究的發(fā)現(xiàn)為α-硫辛酸在RA的臨床應用奠定了理論基礎。