張煒，魏珍星，郭潔，張嚴(yán)樂

喉癌是一種臨床常見頭頸部惡性腫瘤，其中約85%～90%為喉鱗狀細(xì)胞癌，在耳鼻喉咽喉科腫瘤中排第3 位，且近來發(fā)病率呈上升趨勢。雖然手術(shù)、放化療等治療方式對提高病人5 年生存率已有很大突破，但手術(shù)致殘、放化療出現(xiàn)的嚴(yán)重不良反應(yīng)等限制其應(yīng)用，導(dǎo)致此種疾病仍嚴(yán)重威脅人類健康。研究報(bào)道，空氣污染、病毒感染、飲酒、吸煙、抑癌基因失活及原癌基因激活等因素是導(dǎo)致喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，但迄今為止，喉鱗狀細(xì)胞癌的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼小RNA，長度約18～25 個(gè)核苷酸，在細(xì)胞增殖、凋亡、能量代謝等過程及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近來研究報(bào)道，微小RNA-129-5p（microRNA-129-5p，miR-129-5p）下調(diào)與肺癌、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌等多種癌癥發(fā)生、發(fā)展及癌細(xì)胞增殖分化有關(guān)，但關(guān)于miR-129-5p在喉鱗狀細(xì)胞癌中的作用鮮有研究。故本研究擬通過檢測喉鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-129-5p 表達(dá)水平，探究miR-129-5p 對喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞增殖、侵襲的影響，以期為喉鱗狀細(xì)胞癌的治療提供一定理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院2015年1月至2019年2月收治的喉鱗狀細(xì)胞癌病人58例，癌變組織切除手術(shù)中采集喉鱗狀細(xì)胞癌及距離喉鱗狀細(xì)胞癌組織大于1 cm 處癌旁正常喉粘膜上皮組織標(biāo)本，置于液氮中保存?zhèn)溆谩Ｋ胁∪诵g(shù)前均未接受放化療及生物治療，且均經(jīng)病理證實(shí)。研究對象或其近親屬簽署知情同意書，本研究所用方法符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》，且經(jīng)鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)后實(shí)施（倫理批號20150327）。

1.2 細(xì)胞、主要儀器及試劑

喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞株（批號JKCS0277，美國ATCC）購自上海晶抗生物工程有限公司；總RNA 提取試劑（Trizol）、二甲基亞砜（DMSO）、蛋白抽提及二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒均購自上海碧云天有限公司，批號分別 為R0016、ST038、P0028、P0010S；PrimeScript ?RT reagent Kit（TaKaRa）、microRNA 定 量（qRTPCR）試劑盒（TaKaRa）均購自大連寶生物科技有限公司，批號分別為RR037A、638315；DMEM∕F-12 培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco 公司，批號分別為12634010、10 099141；miR-129-5p mimics、miR-129-5p mimics NC 購自上海吉瑪生物科技有限公司；Lipofectamine ?2000 轉(zhuǎn) 染 試 劑 盒（批 號：11668027，美國，Thermo 公司）；噻唑藍(lán)（MTT）、一抗鼠源原癌基因（c-Myc）、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloprotein2，MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein9，MMP-9）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體、二抗羊抗鼠IgG 均購自美國Invitrogen，批號分別為V13154、13-2500、33-3500、MA5-14186、MA5-14228、MA5-15739、B-2752。紫外分光光度計(jì)、二氧化碳培養(yǎng)箱均購自美國Thermo 公司；RT-qPCR7500 儀、MODEL550 型酶標(biāo)儀均購自美國Bio-Rad 公司；Ⅸ73 倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 RT-qPCR檢測喉鱗狀細(xì)胞癌組織及Hep-2細(xì)胞中miR-129-5p 水平 Trizol 提取喉鱗狀細(xì)胞癌、癌旁組織及Hep-2 細(xì)胞中總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測總RNA 濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄制備互補(bǔ)DNA（cDNA）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（RT-qPCR）檢測樣品中miR-129-5p 水平。反應(yīng)體系（20 μL）：TB Green Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，cDNA（50 ng∕μL）2 μL，上下游引物（10 μM）各0.8 μL，ddH2O 6.0 μL。反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40 個(gè)循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，采用2法計(jì)算miR-129-5p的相對表達(dá)水平。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)：Hep-2 細(xì)胞復(fù)蘇后接種于DMEM∕F-12培養(yǎng)基［含有10%胎牛血清（FBS）、1%青鏈霉素］，置于37 ℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：（1）轉(zhuǎn)染前1 d（細(xì)胞匯合至30%～50%）更換不含抗生素培養(yǎng)基，（2）用無血清opti-MEM培養(yǎng)基50 mL分別稀釋1.25 mL微小RNA-129-5p模擬物（miR-125-5p mimics），2.5 mL miR-125-5p 模擬物-空白對照組（mimics-NC），輕輕混勻，室溫靜置5 min；（3）用無血清opti-MEM 培養(yǎng)基50 mL 稀釋1 mL 轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體（Lipofectamine）2000，室溫靜置5 min；（4）將“（2）”與“（3）”分別輕輕混勻，室溫靜置20 min；（5）將miR-125-5p mimics∕NC 轉(zhuǎn)染試劑混合液分別逐滴加入培養(yǎng)板中，輕輕混勻。分別設(shè)轉(zhuǎn)染miR-125-5p mimics 為mimics組，轉(zhuǎn)染miR-125-5p mimics NC為mimics-NC組，另設(shè)無任何轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞為空白對照組（NC），每組6 個(gè)重復(fù)。（6）培養(yǎng)4～6 h后，更換新鮮生長培養(yǎng)基，置于37 ℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。

1.3.3 四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞增殖 取對數(shù)期生長的Hep-2細(xì)胞，以約5.0×10個(gè)∕孔的濃度接種于96 孔板，添加培養(yǎng)液200 微升∕孔。分別轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimics∕NC培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，另設(shè)陰性對照組，轉(zhuǎn)染步驟及分組同1.3.2。培養(yǎng)結(jié)束后用MTT試劑盒檢測mimics組、mimics-NC 組、NC 組各孔細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞增殖抑制率＝（1-實(shí)驗(yàn)組OD∕NC組OD）×100%。

1.3.4 平板克隆試驗(yàn)檢測喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞克隆能力 取對數(shù)期Hep-2細(xì)胞，胰酶消化后以200個(gè)∕孔接種于6 孔板，細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimics∕NC 處理48 h，設(shè)置陰性對照組，按照1.3.2 項(xiàng)下進(jìn)行轉(zhuǎn)染和分組，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)14 d，待肉眼可見克隆集落時(shí)停止培養(yǎng)。甲醛固定，瑞士染液染色，顯微鏡下觀察，以單個(gè)克隆中細(xì)胞數(shù)＞50 作為克隆計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。平板克隆形成率＝（平均克隆數(shù)∕每孔加入單細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.3.5 Transwell試驗(yàn)檢測喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞侵襲能力 本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)方法，在Transwell板上進(jìn)行操作。倒置顯微鏡觀察穿過膜的細(xì)胞數(shù)，每張膜隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野穿過膜微孔的細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.3.6 喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞增殖及侵襲相關(guān)蛋白檢測 收集轉(zhuǎn)染后各組培養(yǎng)48 h 喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。二喹啉甲酸（BCA）測量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品（60 微克∕孔）上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至NC 膜，5%脫脂奶粉封閉，加一抗細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）抗體1∶500；c-Myc 抗體1∶500；基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）抗體1∶500；基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）抗體1∶1 000；β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體1∶500；4 ℃孵育過夜，洗去一抗，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗去二抗，化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 miR-129-5p 在喉鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織中的表達(dá)水平比較

與癌旁組織（1.03±0.14）比較，喉鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-129-5p（0.48±0.08）表達(dá)水平顯著降低（t＝25.977，P＜0.001）。

2.2 上調(diào)miR-129-5p 抑制喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞增殖

與NC 組、mimics-NC 組比較，mimics 組miR-129-5p 表達(dá)水平、Hep-2 細(xì)胞增殖抑制率均顯著增加（P＜0.05）。與24 h比較，mimics組48 h miR-129-5p 表達(dá)水平、喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞增殖抑制率顯著增加（P＜0.05）。與48 h 比較，mimics 組72 h miR-129-5p 表達(dá)水平、喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞增殖抑制率增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同轉(zhuǎn)染時(shí)間，NC 組、mimics-NC 組miR-129-5p 表達(dá)水平、喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞增殖抑制率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示48 h 轉(zhuǎn)染效果最好，可用于下游試驗(yàn)。詳見表2。

2.3 上調(diào)miR-129-5p 抑制喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞克隆形成

NC 組（98.96±10.60）%、mimics-NC 組（97.57±10.82）%平板克隆形成率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.334，P＝0.970）。與NC 組、mimics-NC組比較，mimics組（46.91±9.03）%喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞平板克隆形成率顯著降低（t＝12.523、12.188，均P＜0.001）。詳見圖1。

表2 上調(diào)miR-129-5p抑制喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞增殖∕

圖1 miR-129-5p對喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞克隆能力的影響（每組選取了兩張平板克隆）

2.4 上調(diào)miR-129-5p 抑制喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞侵襲

與NC 組（235.62±36.18）、mimics-NC 組（227.31±35.90）侵襲細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.645，P＝0.893）。與NC組、mimics-NC組比較，mimics組喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少（t＝10.955、10.310，均P＜0.001）。詳見圖2。

圖2 顯微鏡下侵襲喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞數(shù)量（200×）：A為空白對照組；B為miR-125-5p模擬物-空白對照組；C為miR-125-5p模擬物

2.5 上調(diào)miR-129-5p抑制喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞增殖相關(guān)c-Myc、Cyclin D1 蛋白表達(dá)

NC 組、mimics-NC 組c-Myc、Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與NC組、mimics-NC組比較，mimics 組喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞c-Myc、Cyclin D1表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。詳見表3、圖3。

表3 喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞增殖相關(guān)c-Myc、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平∕

圖3 WB檢測喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞增殖相關(guān)c-Myc、Cyclin D1蛋白表達(dá)

2.6 下調(diào)miR-129-5p 抑制喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞侵襲相關(guān)MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)

NC 組、mimics-NC 組MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與NC 組、mimics-NC組比較，mimics組Hep-2細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。詳見表4、圖4。

3 討論

隨著近來高通量測序及芯片技術(shù)的發(fā)展，人們對miRNA 的功能研究不斷深入，越來越多研究發(fā)現(xiàn)，miRNA異常表達(dá)與包括喉癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miRNA在喉癌中上調(diào)表達(dá)，可發(fā)揮促癌基因作用，miRNA下調(diào)表達(dá)，則發(fā)揮抑癌基因作用。范鈺等研究報(bào)道，miR-21 在喉癌組織中上調(diào)表達(dá)，下調(diào)miR-21可抑制喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞增殖及侵襲。侯素平等研究報(bào)道，miR-1264 在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中下調(diào)表達(dá)，上調(diào)miR-1264 可抑制喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。Cheng等研究報(bào)道，miR-129-5p在肺癌組織中顯著下調(diào)，miR-129-5p可通過靶向抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEFG）抑制肺癌H1299 細(xì)胞、SPSA1細(xì)胞增殖遷移和侵襲能力。Han，Wang研究報(bào)道，miR-129-5p在骨肉瘤及細(xì)胞系中顯著下調(diào)，miR-129-5p 可通過直接靶向抑制Rho-相關(guān)蛋白激酶1（ROCK1）基因抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-129-5p在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，提示miR-129-5p下調(diào)可能與喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生有關(guān)。

表4 喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞侵襲相關(guān)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平∕

圖4 WB檢測喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞侵襲相關(guān)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-129-5p 與喉鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系，本研究以喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞為模型，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimics、MTT、平板克隆、侵襲等體外細(xì)胞試驗(yàn)探討miR-129-5p 多喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組及mimics-NC 組比較，轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimics 48h 使miR-129-5p 顯著上調(diào)4 倍以上，且對喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞增殖抑制率達(dá)50%以上，提示轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimics 48 h 轉(zhuǎn)染效率及抑制效率最佳，可用于下游試驗(yàn)。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，侵襲和轉(zhuǎn)移能力也是癌細(xì)胞區(qū)別與正常細(xì)胞的最基本特征，是導(dǎo)致惡性腫瘤復(fù)發(fā)病情惡化，最終死亡的病理基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-129-5p 與骨癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組、mimics-NC 組比較，mimics 組喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞平板克隆形成率及侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著降低，提示過表達(dá)miR-129-5p可抑制喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞增殖、侵襲能力。原癌基因c-Myc 和G1∕S 特異性周期蛋白Cyclin D1 在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)，可加速腫瘤細(xì)胞增殖及惡化程度。MMP家族蛋白成員MMP-2、MMP-9，可破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，促進(jìn)其侵襲、轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，與NC組、mimics-NC 組比較，mimics 組喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞中c-Myc、Cyclin D1 蛋白及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-129-5p可影響喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及侵襲，提示miR-129-5p 可能在喉鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮類似抑癌基因作用。

綜上所述，miR-129-5p 在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá)，上調(diào)miR-129-5p 可抑制喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 細(xì)胞增殖、侵襲能力。但關(guān)于miR-129-5p 的靶向調(diào)控基因及影響喉鱗狀細(xì)胞癌miR-129-5p 增殖、侵襲的靶向調(diào)控基因及可能相關(guān)通路尚不清楚，后期需進(jìn)一步深入研究。