汪霞平 楊勸生

1.甘肅天水岐黃藥業(yè)有限責任公司，甘肅 天水741018；2.甘肅工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，甘肅 天水741025

“濃縮當歸丸”收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑》第十七冊（編號：WS3-B-3279-98），是由當歸一味中藥材制備而成，具有“養(yǎng)血活血、調(diào)經(jīng)止痛”之功效，臨床上用以治療月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)，經(jīng)來腹痛等病癥［1］。因產(chǎn)品注冊時制定的標準比較寬泛，僅收載了“對照藥材的薄層鑒別”和“醇浸出物的含量測定”項，沒有制定相應(yīng)的活性藥效成分控制指標。為了保證治療疾病基礎(chǔ)物質(zhì)的穩(wěn)定，降低批次間的指標差異，控制其內(nèi)在質(zhì)量，本文通過薄層色譜法和高效液相色譜法對濃縮當歸丸的主要成分阿魏酸和藁本內(nèi)酯進行檢測［2-3］，建立含量測定方法，為提高濃縮當歸丸的質(zhì)量提供技術(shù)支撐。

1 儀器與試藥

島津LC-15C 型高效液相色譜儀、KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器、HH-4 高精度數(shù)顯恒溫水浴鍋、WFH-201BJ 紫外可見透射反射儀、CP214 型萬分之一電子天平、CPA225D 型十萬分之一電子天平、色譜工作站為SPD-15C、色譜柱為島津S/N.1A7163348 等。甲醇（批號：190719；生產(chǎn)單位：四川西隴科學有限公司）、乙醚（批號：180601；生產(chǎn)單位：四川西隴科學有限公司）、鹽酸（批號：160829；生產(chǎn)單位：四川西隴科學有限公司）、二氯甲烷（批號：181018；生產(chǎn)單位：四川西隴科學有限公司）、乙酸乙酯（批號：181102；生產(chǎn)單位：四川西隴科學有限公司）、環(huán)己烷（批號：2018071901；生產(chǎn)單位：成都市科隆化學品有限公司）、甲酸（批號：20150702；生產(chǎn)單位：山東普利斯化工有限公司）等分析純試劑。阿魏酸對照品（批號：110773-201614）、藁本內(nèi)酯對照品（批號：111737-201608）、當歸對照藥材（批號：120927-201617）均購自中國食品藥品檢驗研究院。濃縮當歸丸（天水岐黃藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號：170801、171001、171205、180102、180201、180602、180903、181113、190104、190307、190503、190712、191104、191206、191210）

2 TLC 鑒別

2.1 制備供試品溶液 精密稱取本品5g，研細，加1%NaHCO3溶液85mL，超聲處理10min，離心5min，取上清液用稀HCl 調(diào)pH 值至2～3，用乙醚（DEE）振搖提取2 次，每次30mL，合并乙醚液（EDD），揮干，殘渣加甲醇1mL 使溶解，作為供試品溶液。

2.2 制備對照品溶液 取阿魏酸對照品和藁本內(nèi)酯對照品，加甲醇制成每1mL 各含1mg 的溶液，作為對照品溶液。

2.3 制備陰性對照品溶液 按制劑工藝量和方法，取除當歸藥材的藥用輔料按2.1 項下操作方法制備成缺當歸藥材的陰性對照品溶液。

2.4 鑒別 分別吸取上述供試品、對照品、陰性對照品溶液各10μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4 ∶1 ∶1 ∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與阿魏酸對照品和藁本內(nèi)酯對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照樣品無斑點，見圖1。

3 含量測定

3.1 對照品溶液的制備 取阿魏酸（C10H10O4）對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1mL含阿魏酸（C10H10O4）12μg 的溶液，即得。

3.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取約0.25g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.3 陰性對照溶液的制備 取空白樣品，按“供試品溶液的制備”項下方法，制得陰性對照溶液。

3.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 實驗色譜柱：Phnomenx C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-0.085%磷酸溶液（17 ∶83）；檢測波長：316 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫35℃；進樣量：10μL。在此色譜條件下，取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10μL分別進樣，結(jié)果，供試品色譜中，阿魏酸峰峰形對稱，分離良好。HPLC 圖譜見圖2。

3.5 線性關(guān)系的考察 精密吸取上述對照品溶液1、2、5、10、15 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，在上述色譜條件下各進樣10μL 測定，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得阿魏酸回歸方程為Y=34.3441 X-0.6451（r=0.9999，n=6）。結(jié)果表明，阿魏酸在0.024～0.060 μg 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

3.6 精密度試驗 精密量取對照品溶液10μL，注入HPLC，重復(fù)測定5 次，阿魏酸峰面積的RSD=0.13%（n=5），結(jié)果表明精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗 在上述色譜條件下，取室溫條件放置的供試品溶液，分別于0、1、3、6、12、24 h 各進樣一次，測定峰面積積分值，計算得對照品的RSD=0.15%，供試品的RSD=0.54%，結(jié)果表明對照品和供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.8 重復(fù)性試驗 取濃縮當歸丸（批號：190104，含量0.5633mg/g），平行制備6 份供試品溶液，按樣品測定法測定，計算阿魏酸的含量，結(jié)果RSD=0.42%，表明該方法重復(fù)性較好。

3.9 回收率試驗 采用加樣回收法，精密吸取已知含量的濃縮當歸丸（191210）6 份，精密稱定，分別精密加入阿魏酸對照品溶液（濃度：0.56 mg/g）0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL，按“3.2”方法制備測試樣品，在上述色譜條件下測定阿魏酸的含量，結(jié)果平均回收率為99.73%，RSD=0.59%（n=3），表明本法回收率良好。結(jié)果見表1。

3.10 樣品含量測定 取3 批次樣品，按“3.2”方法制備下所述方法分別制得供試品溶液，在上述色譜條件下，分別吸取對照品及供試品溶液各10μL 注入液相色譜儀，按外標法計算樣品中阿魏酸（C10H10O4）的含量，結(jié)果見表2。

圖1 TLC 圖

圖2 HPLC 色譜圖

表1 回收率試驗結(jié)果（n=6）

表2 樣品含量測定結(jié)果

4 小結(jié)

阿魏酸可溶于水、醇、醋酸乙酯等溶劑，在制劑中易于被提取［4］。Gao J 等［5］對當歸揮發(fā)油進行GC-MS測定，分離和鑒定了包括藁本內(nèi)酯、正丁烯酰內(nèi)酯、倍半萜類化合物等30 多種化合物。阿魏酸不僅是優(yōu)良的抗氧化劑，也是被普遍認可的防癌物質(zhì)，與藁本內(nèi)酯是濃縮當歸丸藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)［6］。阿魏酸和藁本內(nèi)酯薄層定性鑒別分離度好，檢驗專屬性強，可收載于該制劑的質(zhì)量標準中。本研究采用了HPLC 測定了濃縮當歸丸中阿魏酸的含量，方法比較簡便，結(jié)果準確，可靠性良好，可用于有效控制本制劑的質(zhì)量。根據(jù)15 個批次樣品檢測的結(jié)果，其阿魏酸的含量在0.4997～0.5914mg/g 之間，平均含量為0.5390mg/g。考慮當歸藥材批次間的差異性和產(chǎn)品制備中的損失情況［7］，故以其最低含量0.4997mg/g 為基礎(chǔ)下浮10%確定控制限量值，即濃縮當歸丸中含阿魏酸（C10H10O4），不得少于0.45mg/g。