孟磊 陳習(xí)超 侯麗瓊 陳雁飛

蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州730000

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種慢性炎癥性自身免疫性疾?。?］，主要侵犯骶髂關(guān)節(jié)、脊柱骨突、脊柱旁軟組織及外周關(guān)節(jié)。AS 確切病因尚未完全明確，傳統(tǒng)的抗風(fēng)濕藥物不能很好地控制病情進展，且藥物不良反應(yīng)較大［2］。研究發(fā)現(xiàn)，AS 患者關(guān)節(jié)滑液中TNF-α 水平升高，使用TNF-α 拮抗劑可抑制AS患者的炎性因子水平［3］。血小板微粒（platelet microparticle，PMPs）可攜帶血小板激活產(chǎn)生的大量生物活性物質(zhì)，是體內(nèi)促炎癥分子的主要來源。研究表明，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑液中存在PMPs，導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑液中的成纖維細胞激活，從而促進關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生［4］。目前國內(nèi)外關(guān)于PMPs 與AS 相關(guān)性的報道較少，對于PMPs 在AS 發(fā)生機制及臨床治療中的作用缺乏相關(guān)研究。本研究通過比較AS 患者與健康對照組血漿PMPs含量的差異、AS 患者治療前后及不同治療方法之間PMPs 變化情況，探討PMPs 對AS 患者的臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2018 年6 月至2019 年10 月于我院風(fēng)濕免疫科收治確診的AS 患者59 例，入選標(biāo)準(zhǔn)符合美國風(fēng)濕病學(xué)會1984 年修訂的AS 紐約分類標(biāo)準(zhǔn)［5］。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心肌梗死者；②合并周圍血管栓塞性疾病者；③合并其他自身免疫疾病者；④腫瘤患者；⑤發(fā)病前2 周有炎性病變史或入院時發(fā)生感染性疾病者（如嚴(yán)重的上呼吸道感染、肺炎、高熱等）；⑥有嚴(yán)重肝腎功能不全者。同時納入健康對照組30 例，排除心、肝、肺、腦等器質(zhì)性病變，無腦梗死、腦出血、炎癥、腫瘤、血液病和免疫性疾病，1 個月內(nèi)無手術(shù)史，所有對象近2 周內(nèi)均未應(yīng)用過免疫抑制劑及抗血小板或抗凝藥物。本研究取得我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。兩組一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 臨床資料。詳細記錄每例AS 患者及健康對照組的年齡、性別、BMI、魏氏法檢測血沉（ESR），速率散色比濁法檢測C 反應(yīng)蛋白（CRP）。

1.2.2 藥物治療。所有AS 患者確診后開始治療。傳統(tǒng)方法治療組35 例，口服非甾體抗炎藥聯(lián)合柳氮磺吡啶（1.0g 2 次/日）；TNF-α 拮抗劑組24 例，使用注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白（25mg 2 次/周皮下注射）。治療3 個月后魏氏法檢測ESR，速率散色比濁法檢測CRP。

1.2.3 全血標(biāo)本處理。取AS 患者治療前后及健康對照組清晨空腹靜脈血5mL，以枸櫞酸鈉抗凝，輕輕混勻后于180×g 離心10min，得到富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）；將PRP 移至離心管，2500×g 離心10min，上清液即乏血小板血漿（platelet poor plasma，PPP），凍存于-80℃冰箱。

1.2.4 PMPs 檢測。用抗原標(biāo)記物CD42a+、CD42a+/CD31+標(biāo)記PMPs，檢測采用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的抗CD42aIGg 單克隆抗體（購自BD 生物公司）與藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的抗CD31IGg 單克隆抗體（購自BD 生物公司），流式細胞術(shù)檢測CD42a、CD31 絕對數(shù)，結(jié)果用Flow jo 軟件分析。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組PMPs 及CRP、ESR 差異；TNF-α 拮抗劑治療與傳統(tǒng)方法治療前后PMPs 及CRP、ESR 差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS18.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行正態(tài)性檢驗，AS 組與健康對照組間比較采用獨立樣本t檢驗，AS 治療前后比較采用配對樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者PMPs 及CRP、ESR 比較 與健康對照組比較，AS 患者CRP、PMPs、CD42a+、CD42a+/CD31+均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者PMPs 及CRP、ESR 比較

2.2 不同方法治療前后PMPs 及CRP、ESR 比較 與治療前相比，兩種方法治療后PMPs 降低、CRP 下降，ESR 減慢，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與傳統(tǒng)療法相比，TNF-α 拮抗劑治療后AS 患者PMPs、CRP、ESR 下降更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 AS 患者治療前后PMPs 及CRP、ESR 比較

3 討論

AS 患者以男性居多且發(fā)病較早，男女發(fā)病比例約為2～3∶1，約80%患者30 歲之前發(fā)病，男性病情發(fā)展速度更快，癥狀更明顯［6，7］。AS 病變主要以中軸關(guān)節(jié)慢性炎癥為主，典型癥狀為骶髂關(guān)節(jié)炎，病變發(fā)展至晚期出現(xiàn)脊柱強直，呈“竹節(jié)”樣改變，關(guān)節(jié)外癥狀主要表現(xiàn)為急性葡萄膜炎與虹膜炎、主動脈關(guān)閉不全和傳導(dǎo)阻滯及腎臟淀粉樣變等。本病致殘率較高，嚴(yán)重影響患者的正常工作生活。CRP 是人類緊急情況下產(chǎn)生的一種與炎癥反應(yīng)相關(guān)的非特異性急性反應(yīng)蛋白，CRP 升高表明體內(nèi)存在炎癥，且CRP 越高表明炎癥越嚴(yán)重［8］，CRP可作為AS 患者病情活動及臨床療效的評價指標(biāo)之一。ESR 是一項實用的急性時相指標(biāo)，可反映機體炎癥和組織損傷，ESR 升高程度與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［9］。本研究中AS 組CRP、ESR 相較于健康對照組均明顯升高，提示AS 患者均有不同程度的炎癥反應(yīng)。

AS 患者是以中軸關(guān)節(jié)無菌性炎癥為主要特征的慢性、進展性免疫炎性疾病。細胞因子是參與免疫炎癥反應(yīng)的重要分子，T、B 淋巴細胞、巨噬細胞、滑膜成纖維細胞均參與炎癥的形成。PMPs 是活化或凋亡的血小板出芽脫落形成的一種超微囊泡結(jié)構(gòu)，在電鏡下直徑介于100nm～1000nm 之間，占細胞微?？倲?shù)的70%～90%［10，11］。血小板膜上表達的40 多種糖蛋白及許多活化標(biāo)志物大多可在PMPs 膜上表達，如GPIb、GPIa、GPIIa、GPIIb/IIIa、GPVI 及蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶、趨化因子受體等。循環(huán)中PMPs 的含量反映了血小板的活化程度。PMPs 攜帶血小板激活產(chǎn)生的大量生物活性物質(zhì)，而這些物質(zhì)是體內(nèi)促炎癥分子的主要來源。其中分化抗原CD40 配體（CD40L）可通過活化單核巨噬細胞分泌趨化因子，使巨噬細胞聚集，促進炎癥的發(fā)生，而循環(huán)中可溶性的CD40L 大部分來源于血小板及其微粒，因此，PMPs 具有顯著的促炎作用［12］。另外，體外凋亡產(chǎn)生的PMPs 可以與單核細胞結(jié)合，誘導(dǎo)其在纖維粘連蛋白表面黏附并向M2 亞型轉(zhuǎn)化，進而成為巨噬細胞發(fā)揮致炎作用［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，AS 患者PMPs較健康對照組明顯升高，表明PMPs 可能通過其促炎作用參與AS 的發(fā)生及病情活動，與王鋒等［14］研究結(jié)論一致。而國外Ismail S 等［15］的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AS 患者組與健康對照組PMPs 濃度差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但該研究納入病例僅限于男性，且均為輕度疾病活動的患者。因此，PMPs 與AS 的關(guān)系仍需進一步研究。

在過去的20～30 年間，盡管在減輕患者癥狀、減緩疾病發(fā)展等方面獲得一定進展，但尚不能完全阻止AS 的進行性關(guān)節(jié)融合，同時高額的治療費用給患者家庭帶來了沉重的負擔(dān)。對AS 患者的傳統(tǒng)治療主要以非甾體抗炎藥（NSAIDs）以及緩解病情抗風(fēng)濕的藥物（DMARDs）為主。本研究AS 患者傳統(tǒng)方法治療組35例，口服NSAIDs 聯(lián)合柳氮磺吡啶（1.0g 2 次/日）3 個月取得了較好的效果，患者臨床癥狀緩解，CRP、ESR 及PMPs 較治療前均有所下降。臨床上AS 患者服用NASIDs治療后晨僵以及腰背疼痛等癥狀均有所緩解，患者活動范圍增加，關(guān)節(jié)腫脹減輕，但服用此類藥物后患者易出現(xiàn)胃腸不適以及肝腎功能受損等較多不良反應(yīng)。目前最常用的DMARDs 類藥物為柳氮磺胺砒啶，該藥物對AS 患者的外周關(guān)節(jié)癥狀得到良好改善，但由于該藥物可引起患者消化系統(tǒng)不良反應(yīng)、抑制造血系統(tǒng)的正常造血功能，部分患者甚至出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)不良反應(yīng)，影響生殖功能，難以耐受。

AS 可能與遺傳、感染、免疫功能紊亂及某些生物因子相關(guān)。研究表明，TNF-α、白介素、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）家族等均與AS 的疾病活動相關(guān)，每個細胞因子均具有多效性，效應(yīng)互相重疊協(xié)同［16］。已有的針對細胞因子的拮抗劑在AS 的治療中發(fā)揮了一定的作用［17］。TNF-α 主要由單核細胞、巨噬細胞、胸腺依賴淋巴細胞合成并分泌，主要功能為促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展，調(diào)節(jié)自身免疫。AS 患者體內(nèi)TNF-α 升高可促進炎癥瀑布反應(yīng)，同時TNF-α 通過IG 對F-1、Osx 等因子的抑制作用而抑制成骨細胞分化，并刺激破骨形成，從而影響AS 患者的預(yù)后?，F(xiàn)階段臨床上使用的TNF-α拮抗劑主要包括大分子抑制劑和小分子活性抑制劑。本研究24 例AS 患者接受抗TNF-α 生物治療，使用注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，AS 患者PMPs 及CRP 均明顯下降，血沉減慢，提示TNF-α 拮抗劑對于緩解AS 患者急性炎癥反應(yīng)有顯著療效，尤其對癥狀顯著、CRP、ESR 提示嚴(yán)重炎癥反應(yīng)的患者治療效果比NASIDs 及DMARDs 類藥物效果更佳［18］。長期慢性炎癥、免疫異常、骨破壞骨贅形成的過程會導(dǎo)致AS 患者體內(nèi)TNF-α、IL-17 和IL-23 等炎癥因子大量產(chǎn)生，血小板、內(nèi)皮細胞和淋巴細胞等活化或凋亡，在其活化或凋亡過程中，會促進PMPs 的釋放，表現(xiàn)為PMPs 表達升高［16］。本研究中兩種治療方法AS患者PMPs 與治療前相比均下降，但TNF-α 拮抗劑治療比傳統(tǒng)治療下降更加明顯，表明TNF-α 拮抗劑可能通過抑制TNF-α 的活性進而快速的減少PMPs 的釋放，降低PMPs 的表達。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PMPs 可能在AS 炎癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，AS 患者外周血中PMPs 水平與炎癥指標(biāo)密切相關(guān)，在一定程度上反映了體內(nèi)炎癥水平，作為一種炎性指標(biāo)對AS 患者診斷及治療均有重要的臨床意義，但是目前尚無法明確PMPs 影響AS發(fā)生及病情發(fā)展的具體機制，我們將在今后的工作中對這一問題進行深入研究。