張德馨，王淑華，孫 仟，林 林，張 雪，林永強＊

（1. 山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；2. 國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京 100022；3. 山東省食品藥品檢驗研究院 國家藥品監(jiān)督管理局膠類產(chǎn)品質量評價重點實驗室，山東 濟南 250101）

山楂是藥食兩用的傳統(tǒng)中藥材，能消食健胃、活血化淤、收斂止痢，對肉積痰飲、小兒乳食停滯等均有療效。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)山楂葉也有很高的藥用價值，黃酮類物質如牡荊素，6, 8-二葡萄糖芹菜素，黃酮苷，牡荊素葡萄糖苷，槲皮素，金絲桃苷（HP），山柰酚，木犀草苷，牡荊素鼠李糖苷（VOR）等是其提取物中的主要活性成分[1]，具有調節(jié)脂質和糖代謝、護肝、抗氧化、擴張冠狀動脈等多種藥理活性。

目前，山楂葉總黃酮（HLF）的提取方法不斷創(chuàng)新，對其藥效機制的研究也有了新的突破。本文對近年HLF的提取工藝與藥理活性的研究成果加以歸納，以期為山楂資源的開發(fā)與合理利用提供參考。

1 HLF的提取工藝

1.1 浸提法

姜紅紅等[2]采用70 %乙醇，料液比1:10（g/ml），70 ℃條件下保持微沸提取2.5 h，用LX158型號樹脂，3 BV水洗除雜后，用10 %乙醇洗脫除雜，6 BV的30 %乙醇洗脫的方案，依據(jù)藥典方法進行分離條件優(yōu)化，解決了現(xiàn)有山楂葉提取物的制備方法成本高、總黃酮含量低的技術問題。

1.2 回流提取法

施紅林等[3]發(fā)現(xiàn)在液固比29 ml/g，乙醇體積分數(shù)68 %，水浴溫度64 ℃，提取時間34 min的條件下HLF的平均粗提取率只有3.07 %。宋小峰等[4]采用醇提法，較施紅林等[3]延長了提取時間與溫度，使總黃酮提取率達到92.2 %，優(yōu)選出最佳的提取工藝為乙醇體積分數(shù)65 %，提取時間80 min，提取溫度（67±1）℃。

1.3 超聲波輔助提取法

趙永福等[5]采用超聲波輔助提取法，在乙醇濃度50 %，料液比1:24（g/ml），pH 7，提取溫度 60 ℃，提取時間0.5 h 條件下HLF得率為2.43 %。弓威等[6]比較乙醇回流，超聲波輔助提取，普通浸提法等提取工藝的優(yōu)劣，發(fā)現(xiàn)超聲波輔助提取法明顯優(yōu)于其他方法。最終采取乙醇體積分數(shù)70 %、料液比1:35、超聲功率480 W、提取時間39 min、提取溫度72 ℃的方案，顯著縮短了時間，HLF平均得率為28.991 mg/g。磨正遵等[7]優(yōu)化超聲波輔助提取條件為超聲波功率140 W、料液比1:56、提取時間120 min、溫度59 ℃。該方法克服了傳統(tǒng)有機溶劑易污染黃酮成分的缺點。

1.4 超高壓萃取法

奚玉石等[8]首次把超高壓技術應用到HLF的提取上，將山楂葉粉碎干燥，與45倍量50 %乙醇在無菌條件下混合塑封，300 MPa壓力下處理10 s，提取1次。結果表明超高壓技術不僅能在較短時間內獲得較高的提取率，且提取液的顏色澄清，雜質少。周志強等[9]提出給壓超過400 MPa時提取率變化不大，與奚玉石[8]提出的由于細胞內溶出的大分子物質阻塞傳質通道，給壓過高不利于黃酮類化合物的擴散的觀點一致。

1.5 微波提取

微波場中釋放的能量被樣品吸收后，產(chǎn)生的熱效應擴可破環(huán)細胞結構，使成分加速溶出。施昶[10]通過響應面試驗優(yōu)化微波提取HLF的條件，最終確定在體積分數(shù)56 %乙醇中浸提15 min，液固比為51 ml/g，微波輻射時間3.70 min的提取條件。

2 藥理作用

2.1 對心血管的影響

2.1.1 治療慢性心衰 賀粵等[11]采用結扎冠狀動脈前降支引起的慢性心衰小鼠模型，發(fā)現(xiàn)200 mg/(kg·d)的HLF能提高小鼠左心室射血分數(shù)，對血管緊張素II（Ang II）、血漿醛固酮的表達有較好的減弱作用，從而抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RRAS）系統(tǒng)，與卡托普利在心衰方面治療作用相當。Holubarsch等[12]對山楂葉醇提物低聚原花青素類成分WS 1442的現(xiàn)有臨床前和臨床數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)該中草藥產(chǎn)品對心力衰竭的浮腫、呼吸困難、疲勞等癥狀療效顯著，可改善輕度至中度心力衰竭患者的心功能和運動耐量，并具有正性肌力作用，且不會引起再灌注心律失常、食欲不振、便秘、肝纖維化等特定的不良反應。

徐穎等[13]采用Ang II致心肌細胞肥大的慢性心衰模型，發(fā)現(xiàn)配合使用200 μg/ml HLF能干預慢性心衰模型中線粒體的功能，減輕心肌細胞中線粒體的內、外膜損傷率，顯著降低心肌細胞直徑，并能下調Ang II所致異常升高的蛋白質含量，從而保護心肌細胞。

2.1.2 保護缺血心肌細胞 心肌酶的濃度可以作為檢測心肌缺血程度的指標。孫建峰等[14]采用麻醉后結扎犬冠狀動脈前左降支方法建立急性心肌梗死模型，發(fā)現(xiàn)使用高、中劑量HLF注射液的動物ST段升高總值及梗死范圍占全心質量百分比、心室質量百分比明顯低于對照組，在血清中檢測到的肌酸磷酸激酶（CPK）、乳酸脫氫酶（LDH）、谷草轉氨酶（AST）等濃度較低，超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，表明HLF可保護缺血心肌細胞結構的完整性，抑制心肌酶的釋放，減少心肌梗死面積。推測其作用機制與減少心肌細胞耗氧量，增加冠脈流量，降低細胞膜的通透性有關。

邱曉梅等[15]研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射HLF對缺血心肌細胞灌注前后的心功能有明顯影響，心肌酶濃度、丙二醛（MDA）濃度降低，SOD水平升高，表明HLF能抑制氧自由基（ROS）引起的脂質過氧化反應，這一結果與Koch等[16]總結山楂葉黃酮對心肌再灌注損傷細胞的作用機制結論一致，即山楂葉黃酮可削弱缺血極早期細胞氧化磷酸化水平降低造成的去極化作用，阻滯鈣內流，減輕細胞鈣超載，增強抗氧化能力，減少室性心律失常的發(fā)生率，對缺血的心肌細胞起直接保護作用。

2.2 抗腦缺血作用

李蒙蒙等[17]對大鼠側頸總動脈永久性雙重結扎，建立慢性腦缺血模型。結果顯示用HLF灌胃的大鼠神經(jīng)細胞形態(tài)完好，密度增加，腦組織病變減輕。表明HLF可減弱因神經(jīng)膠質細胞過度活化分泌的抑制因子、受體及炎癥遞質的表達，減輕炎癥反應，增強神經(jīng)元與軸突的再生能力。還能通過減弱p38分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）表達水平，阻止腦細胞凋亡，調節(jié)腦細胞生長，對血管性癡呆小鼠的記憶力有良好的改善作用[18]。

曲若寧等[19]觀察發(fā)現(xiàn)HLF對腦缺血再灌注模型大鼠損傷的海馬CA1區(qū)有顯著改善，并與治療腦缺血成一定的量效關系，能維持神經(jīng)元細胞的超微結構，減輕神經(jīng)細胞損傷，減少腦組織死亡區(qū)域，其機制與抑制胱天蛋白酶3（caspase-3）蛋白酶的陽性表達，減輕細胞凋亡效應有關。陳進玲等[20]發(fā)現(xiàn)HLF聯(lián)合丁苯酞能調節(jié)老年腦梗死患者總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等血脂水平，能更好地改善大腦動脈血管狹窄，使神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分降低。HLF還能改善缺氧復氧誘導的神經(jīng)細胞損傷，保護作用可能與增強miR-133b表達，進而降低X-連鎖的RNA結合基序蛋白（RBMX）的表達能力有關[21]。

2.3 抗動脈粥樣硬化

高英英等[22]認為HLF可穩(wěn)定動脈組織中基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）的蛋白水平，使纖維帽膠原消融、生長環(huán)境達到平衡，維持血管結構。另外，使用HLF注射液后小鼠血管壁中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）mRNA增加，推測HLF含PPARγ配體類物質，能抑制細胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子1（VCAM-1）的基因表達，阻止單核細胞動脈硬化斑塊遷移，減輕大鼠動脈粥樣硬化血管的內皮損傷程度[23]。于悅卿等[24]研究表明HLF能降低ApoE基因敲除小鼠的TC、TG、LDL-C含量，增強抗炎因子白介素8（IL-8）水平，降低MDA含量，增加SOD含量，調節(jié)動脈硬化導致的內質網(wǎng)應激狀態(tài)。

2.4 保護肝功能

2.4.1 減輕酒精性肝損傷 HLF被證實能通過減少肝細胞凋亡[25]，并清除自由基，提高抗氧化酶活性，抑制脂質過氧化反應來減輕酒精性肝損傷[26]。

2.4.2 減輕非酒精性肝損傷 環(huán)氧合酶-2（COX-2）是引發(fā)炎癥反應的重要介質之一，參與肝臟充血、水腫等癥狀的發(fā)生與發(fā)展。在HLF干預下，高脂導致的肝損傷小鼠體內血紅素氧合酶1（HO-1）的表達增強，COX-2的表達降低，鼠抗8-羥基脫氧鳥苷酸的表達減弱，證明HLF可減輕DNA氧化導致的細胞損傷和肝組織炎癥，顯著提高肝組織總抗氧化能力[27]。

核因子E2相關因子2（Nrf2）在保持氧化和抗氧化之間的平衡及減少氧化應激引起的損傷中起著關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)HLF通過增加Nrf2、HO-1，谷氨酸半胱氨酸連接酶、NAD（P）H醌氧化還原酶1的表達，在抗氧化中起重要作用[28]。反映出HLF可緩解肝臟氧化應激，維持肝細胞功能，祛除炎癥反應，增強肝臟的抗氧化能力。

降低P4502E1 mRNA和蛋白表達是治療非酒精性肝病的靶點。陳芝蕓等[29]發(fā)現(xiàn)隨著給小鼠灌服的HLF濃度升高，對細胞色素P4502E1的抑制活性增加。一方面能使谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、SOD分解過氧化物的活性增強，減少自由基的生成；另一方面可避免脂質積累產(chǎn)生的活性氧誘導下游促炎癥因子的表達。

2.5 降壓調脂質作用

張振等[30]研究發(fā)現(xiàn)，HLF可降低高脂高鹽小鼠血清中CPK、LDH、AST的活性，并提高抗氧化酶如SOD、GSH-Px的活性，保護缺血心肌細胞，還能降低Ang II水平、血脂含量和心臟做功系數(shù)，抑制血管的過度收縮，降低血壓并維持舒張壓和收縮壓的穩(wěn)定。

刁婷婷等[31]以高脂血癥大鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)經(jīng)HLF灌胃處理的大鼠肝臟組織中的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）表達增加，乙酰輔酶A羧化酶（ACC）磷酸化減弱，脂肪酸的合成速度減緩，脂肪變性與浸潤程度減輕，脂質代謝增強，肝臟脂質沉積狀況呈劑量依賴性改善。推測其機制與調節(jié)AMPK/ACC通路的蛋白表達水平有關。HLF還能激活法尼酯衍生物受體，下調固醇調節(jié)元件結合蛋白1c（SREBP-1c）表達，對甘油三酯的積累有一定的消除作用[32]。

另外，HLF還能有效緩解組織培養(yǎng)肝細胞受抑制狀態(tài)，減輕脂肪變性、炎性細胞浸潤、肝細胞腫脹等藥理損傷，能降低羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）、上調低密度脂蛋白受體（LDLR）的陽性表達。HLF不但減少膽固醇的合成，還能清除肝臟中游離的膽固醇[33]。

2.6 治療糖尿病并發(fā)癥與抗氧化作用

2.6.1 治療糖尿病并發(fā)癥 齊淑芳等[34]采用注射鏈脲佐菌（STZ）配合高脂高糖喂養(yǎng)誘發(fā)2型糖尿病大鼠為研究模型，發(fā)現(xiàn)HLF能增強骨形成蛋白-7表達，減弱腎組織轉化生長因子β1的表達，從而改善糖代謝異常為主因所致的腎小球硬化，使腎臟細胞纖維化概率降低，并明顯減輕大鼠腎細胞受損程度及尿蛋白、肌酐、血糖及血尿素氮含量，維持腎臟正常生理功能。趙曉蓮等[35]還發(fā)現(xiàn)HLF對腎小球系膜細胞增生、胞內脂質堆積，腎小管擴張腫脹等病理性改變同樣有治療作用，有明顯降糖效果，對糖尿病腎小球硬化癥早期的微血管病變有良好療效，推測機制與降低腎局部胰島素樣生長因子1（IGF-1）及胰島素樣生長因子結合蛋白3（IGFBP-3）過表達有關。

HLF除了能維持腎臟生理功能外，另有研究表明HLF對STZ誘發(fā)2型糖尿病小鼠的胰腺組織[36]、睪丸[37]、腦組織[38]都有顯著的保護作用。不僅能保護各組織的細胞形態(tài)并降低其凋亡系數(shù)，還能增強組織中抗氧化酶的活性，改善胰腺、睪丸、腦組織中超微結構病變，維持血糖和胰島素分泌的穩(wěn)定性。

韓偉[39]發(fā)現(xiàn)高、中劑量VOR、HP可下調AMPK、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）mRNA表達水平，并明顯降低高糖高脂培養(yǎng)胰島素抵抗（IR）HePG2細胞內的TC、TG積累，維持細胞的糖脂代謝平衡，其機制可能與激活AMPK通路有關。

2.6.2 抗氧化作用 龔霞等[40]萃取山楂葉有機提取物中不同部位的極性組分，比較其對DPPH自由基、超氧自由基及Fe2+螯合能力的影響。結果表明正丁醇相的總還原能力最強，石油醚相的抗氧化能力遠低于其他組分。

李艷榮等[41]發(fā)現(xiàn)山楂葉 50 %乙醇提取物、50 %乙醇的乙酸乙酯部位、50 %乙醇的水飽和正丁醇部位、2015年版《中國藥典》收錄的HLF均具有一定的體外抗氧化能力。且總黃酮含量越高，抗氧化能力越強。

2.7 其他藥理作用

實驗表明HLF能有效降低惡性膠質瘤 U87 細胞的黏附能力，可引起瘤細胞外形皺縮、破損，對瘤細胞增殖、遷移、侵襲能力有明顯抑制作用，作用強度與濃度呈正相關[42]。Zhang等[43]發(fā)現(xiàn)，使用HLF治療后，脊髓損傷大鼠脊髓組織的病變腔和凋亡細胞數(shù)減少，神經(jīng)元水腫減輕、內尼氏小體增多。即HLF能保護受損的大鼠脊髓神經(jīng)，在脊髓損傷后促進軀干恢復運動協(xié)調性中具有治療潛力。

3 討論

在提取工藝方面，黃酮類化合物作為山楂葉的藥效指標成分，單純溶劑提取雖然操作簡單、HLF得率高，但耗時長。超聲波的熱效應與機械振動的助溶作用，會加速細胞內物質的釋放，能縮短時間、提高效率。超高壓提取法短時間內極高的壓力差變化則促進了提取溶劑的滲透及有效成分的溶出，與加熱回流法相比，溶劑的揮發(fā)減少，升壓、保壓、卸壓、加料等單元借助機械完成，也無較大的能量消耗。微波技術可使用更少的溶劑量，使整個物料內部加熱，克服了傳統(tǒng)加熱方法由外向內，升熱較慢的缺點，而微波提取技術與傳統(tǒng)溶劑提取法相結合的方法溫和安全。市面上流通的HLF注射液的制備多為企業(yè)專利，可查閱到的粗提方法有取山楂葉在40 %乙醇、50 ℃下浸提后再加工[44]。而超聲波輔助提取、超高壓提取與微波提取可同時處理較大的批量，選擇性高，能節(jié)約時間和經(jīng)濟成本。

目前，HLF在解決高致病率、高死亡率的心血管問題，參與2型糖尿病并發(fā)癥與肝腎系統(tǒng)損傷的治療中均有良好表現(xiàn)，其抗氧化、抗炎、降脂、調節(jié)酶活性等作用成為研究熱點。山楂樹葉資源有廣闊的開發(fā)前景。