王春生,智亞楠,趙付平,侯夢(mèng)圓,陳利軍

(信陽農(nóng)林學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，河南 信陽 464000)

一些真菌在生長過程中可以產(chǎn)生揮發(fā)性代謝物質(zhì)，主要由醇、苯、醛、烯烴、酸、酯、酮等物質(zhì)組成，這些真菌產(chǎn)生的各種含碳?xì)鈶B(tài)化合物的混合物被稱作真菌揮發(fā)性物質(zhì)(volatile organic compounds，VOCs)[1]。由于這些揮發(fā)性物質(zhì)具有分子量小、易揮發(fā)、能在空氣和土壤中自由擴(kuò)散、良好的細(xì)胞膜穿透性等特性[2-4]，在植物病害防控方面，能快速地?cái)U(kuò)大作用范圍，提高對(duì)靶標(biāo)病原菌的抑制效果[4]。相對(duì)植物揮發(fā)性物質(zhì)，產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)的真菌具有繁殖快、周期短、易培養(yǎng)、易改良、適應(yīng)性強(qiáng)、不受季節(jié)時(shí)令限制等優(yōu)點(diǎn)[5]，因此真菌VOCs作為重要的植物病害生防資源，成為近些年來國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一[6-8]。

產(chǎn)香真菌GS-1菌株無性態(tài)為普通瘤座孢菌(Tubercularia vulgaris)，有性態(tài)為叢赤殼(Nectria cinnabarina)，其揮發(fā)性物質(zhì)香味濃郁，對(duì)多種植物病原真菌具有明顯的熏蒸抑制作用，對(duì)番茄果實(shí)灰霉病具有良好的生防效果，因此具有良好的生防潛能[3]。但目前對(duì)其生物學(xué)特性尚不清楚，限制了其揮發(fā)性物質(zhì)熏蒸抑菌功能的進(jìn)一步研究。本研究通過測(cè)定不同培養(yǎng)條件下菌落直徑來分析溫度、pH值、碳源、氮源和培養(yǎng)基對(duì)GS-1菌株生長的影響，明確GS-1菌株的生物學(xué)特性，以期為GS-1菌株揮發(fā)物的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

產(chǎn)香真菌GS-1菌株由信陽農(nóng)林學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、水1000 mL。

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂粉15 g、水1000 mL。

查氏培養(yǎng)基(CA)：硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂粉15 g、水1000 ml。

麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基(MEA)：麥芽浸膏25 g、瓊脂粉15 g 水1000 ml。

水瓊脂培養(yǎng)基(WA)：水1000 ml、瓊脂粉15 g。

燕麥片瓊脂(OMA)：燕麥片30 g、瓊脂粉15 g、水1000 ml。

1.3 產(chǎn)香真菌GS-1菌株的生物學(xué)特性研究

1.3.1 溫度對(duì)菌絲生長的影響 將GS-1菌株在PDA平皿培養(yǎng)5 d，用無菌打孔器在菌落邊緣取5 mm菌餅，接入新的PDA平皿中央，分別置于13℃、16℃、19℃、22℃、25℃、28℃，共6個(gè)溫度下黑暗培養(yǎng)，每天用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次。

1.3.2 pH值對(duì)菌絲生長的影響 用1 mol/L的鹽酸(HCl)和1 mol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液將PDA的pH值分別調(diào)至3、4、5、6、7、8、9和10，共設(shè)8個(gè)處理。接種GS-1菌株5 mm菌餅后，22℃黑暗培養(yǎng)，每天用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次。

1.3.3 碳源對(duì)菌絲生長的影響 氮源以CA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以等量的可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、果糖代替蔗糖，另設(shè)無蔗糖(無碳源)處理。接種GS-1菌株5 mm菌餅后，22℃黑暗培養(yǎng)，每天用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次。

1.3.4 氮源對(duì)菌絲生長的影響 以CA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以等量的苯丙氨酸、半胱氨酸、蛋白胨、酵母浸膏代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硝酸鈉，另設(shè)無硝酸鈉(無氮源)處理。接種GS-1菌株5 mm菌餅后，22℃黑暗培養(yǎng)，每天用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次。

1.3.5 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長的影響 將GS-1菌株5 mm菌餅分別接種至PDA、PSA、CA、WA、OMA和MEA培養(yǎng)基上，22℃黑暗培養(yǎng)，每天用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用IBM SPSS Statistics 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)GS-1菌株生長的影響

對(duì)不同溫度條件下培養(yǎng)5 d的GS-1菌株菌落直徑進(jìn)行測(cè)量。從圖1可以看出，GS-1菌株在所試的13～28 ℃溫度范圍內(nèi)均能生長，在19～25 ℃的范圍內(nèi)均生長較好，其中22 ℃為最適生長溫度，且與其它所試溫度存在顯著差異。

圖1 溫度對(duì)GS-1菌株生長的影響(5 d) 圖2 pH值對(duì)GS-1菌株菌絲生長的影響(6d)

2.2 pH值對(duì)GS-1菌株生長的影響

不同pH值培養(yǎng)基對(duì)GS-1菌株生長影響的結(jié)果見圖2。產(chǎn)香真菌GS-1菌株在所試的pH值3～10的范圍內(nèi)均可生長，最適pH值范圍為4～7，第6 天菌落平均直徑分別為45.8、48.3、46.2 cm和45.0 cm，顯著大于其他pH值的處理。

2.3 碳源對(duì)GS-1菌株生長的影響

碳源對(duì)GS-1菌株生長影響的結(jié)果見圖3。GS-1菌株在所試的5種碳源和無糖(無碳源)培養(yǎng)基上均可生長，以葡萄糖為最佳碳源，菌落平均直徑與其它碳源處理存在顯著差異，第6 天的菌落平均直徑可達(dá)40.3 cm。GS-1菌株在以果糖、乳糖、蔗糖和可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上也可較好地生長。

2.4 氮源對(duì)GS-1菌株生長的影響

圖3碳源對(duì)GS-1菌株生長的影響(6d)

從圖4看出，GS-1菌株在所試培養(yǎng)基上均可生長，酵母浸膏為最佳氮源，第6 天菌落平均直徑可達(dá)49.3 cm，與其它氮源處理存在顯著差異。GS-1菌株在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上也可較好地生長。

2.5 培養(yǎng)基對(duì)GS-1菌株生長的影響

GS-1菌株在供試的6種培養(yǎng)基上均能正常生長(圖5)，以PDA為最適培養(yǎng)基，第6 天的菌落平均直徑可達(dá)46.3 cm。在WA培養(yǎng)基上的菌落生長最慢，第5 天的平均直徑僅為8.7 cm。

圖4 氮源對(duì)GS-1菌株菌絲生長的影響(6 d) 圖5 不同培養(yǎng)基對(duì)GS-1菌株菌絲生長的影響(5 d)

3 討論

產(chǎn)香真菌GS-1菌株的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)植物病原真菌具有良好的生防效果，其揮發(fā)物是其生防功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。真菌揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生受培養(yǎng)條件的影響[9]，如培養(yǎng)基、溫度、pH值等，因此明確GS-1菌株的生物學(xué)特性，提供適宜GS-1菌株生長的培養(yǎng)條件，是研究其生防功能開發(fā)和利用的前提。

叢赤殼主要寄生于多種樹木的枝干，引起枝枯病、潰瘍病、珊瑚斑病等[10-12]。在叢赤殼屬(Nectria)分類研究中對(duì)叢赤殼的菌落生長情況進(jìn)行了簡單的描述[13]，但未見有關(guān)其生物學(xué)特性的研究報(bào)道。本文研究了溫度、pH值、碳源、氮源、培養(yǎng)基等對(duì)GS-1菌株生長的影響，結(jié)果表明：產(chǎn)香真菌GS-1菌株在19～28 ℃的范圍內(nèi)均生長較好，最適生長溫度為22 ℃；最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為酵母浸膏；最適宜的pH值范圍為4～7；以PDA為最適培養(yǎng)基，其次為PSA和OMA培養(yǎng)基。