張宗啟，吳天祥,2，*，劉力萍

(1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州食品工程職業(yè)學(xué)院， 貴州 清鎮(zhèn) 551400)

灰樹(shù)花(Grifolafrondosa)是近幾年開(kāi)發(fā)出的一種藥食兼用真菌，隸屬于非褶菌目、多孔菌科、樹(shù)花菌屬，又名貝葉多孔菌、栗子蘑、蓮花菌等。日本稱之為“舞茸”(maitake)，美國(guó)稱之為“林雞”(hen of the woods)[1]。近幾年研究表明，灰樹(shù)花多糖作為一種有效的生物免疫調(diào)節(jié)劑，具有明顯的抗腫瘤[2-3]、抗HIV病毒[4]、改善免疫系統(tǒng)功能[5]、治療皮膚病[6]、清除自由基等生理功能[7-8]。天麻(Rhizomagastrodiae)作為貴州三寶之一，是我國(guó)記錄最早和最重要的傳統(tǒng)草藥之一，其主要含有天麻素(gastrodiae，GA)、對(duì)羥基苯甲醛(p-hydroxylbenzaldehyde，HBA)、對(duì)羥基苯甲醇(p-hydroxybenzyl alcohol，HA)、香草醇(vanillyl alcohol，VA)和香草醛(vanillin，VL)等[9-10]。天麻及天麻提取物均可用于抗厥藥、鎮(zhèn)痛藥及預(yù)防全身麻痹、癲癇、眩暈、破傷風(fēng)等[11]，由于其顯著的醫(yī)療效果，在許多國(guó)家被廣泛作為保健品使用。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外不少研究表明外源添加物可以促進(jìn)真菌細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的生成。畢澎洋[12]研究發(fā)現(xiàn)薏苡仁油和薏苡仁酯添加到靈芝發(fā)酵體系中會(huì)影響靈芝胞外多糖的分泌及其胞外多糖組分種類，其中2%薏苡仁油可以促進(jìn)靈芝胞內(nèi)、胞外多糖產(chǎn)量及靈芝酸含量，靈芝酸含量最高為對(duì)照組的4.04倍；Kim等[13]利用中藥牛蒡子提取物成分加入到灰樹(shù)花液體培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)灰樹(shù)花發(fā)酵體系中的酶能將牛蒡子苷轉(zhuǎn)化為苷元，且加入牛蒡子提取物的灰樹(shù)花多糖有抗氧化活性；鄭浩然等[14]在靈芝發(fā)酵體系中添加鐵皮石斛，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛能促進(jìn)靈芝胞外多糖的合成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

對(duì)羥基苯甲醛、香草醇，美國(guó)Sigma公司；葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、無(wú)水乙醇，北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM- 30R型立式滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TS- 2102C型恒溫振蕩器，上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；TDL- 40B型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SW- CJ- 1D型凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；UV- 1800型雙光速紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀及檢測(cè)器、Agilent 5TC- C18色譜柱，美國(guó)Agilent公司。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1灰樹(shù)花培養(yǎng)基配制

斜面種子培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基，g/L)：馬鈴薯(去皮)200、葡萄糖20、蛋白胨2、KH2PO42、MgSO4·7H2O 1、瓊脂20，自然pH值。

液體種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30、蛋白胨2、KH2PO40.5、MgSO4·7H2O 0.5、酵母膏6，自然pH值。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50、蛋白胨5、KH2PO42、MgSO4·7H2O 2、酵母膏10，自然pH值。

1.3.2灰樹(shù)花培養(yǎng)

1)斜面種子培養(yǎng)。從長(zhǎng)滿灰樹(shù)花菌絲體的母種試管中用接種鏟取黃豆粒大小的菌絲塊，接種于PDA培養(yǎng)基試管中部，放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱，至菌絲體長(zhǎng)滿整個(gè)斜面后，轉(zhuǎn)存于4 ℃條件下保藏使用。

2)液體種子培養(yǎng)。用接種勺取1勺長(zhǎng)滿整個(gè)斜面的斜面種子培養(yǎng)基中的菌絲體，接種于液體種子培養(yǎng)基中。250 mL錐形瓶中裝液量為100 mL，放入轉(zhuǎn)子后于旋渦震蕩機(jī)中震蕩5 min，將菌絲體打碎后于25 ℃、1 500 r/min搖床中培養(yǎng)7 d。

3)發(fā)酵培養(yǎng)。在無(wú)菌操作條件下，按10%的接種量，移液槍吸取10 mL液體種子培養(yǎng)基于發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL錐形瓶中裝液量為100 mL，25 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 d左右，至菌液中出現(xiàn)大量大小均勻的菌絲體球且菌液清亮。

1.4 天麻醇提物制備

天麻粉末制備：將新鮮天麻清洗干凈，去除泥土，切碎，60 ℃烘干粉碎后，過(guò)80目篩備用。

準(zhǔn)確稱取20 g天麻粉末，加入200 mL體積分?jǐn)?shù)為75%的無(wú)水乙醇，25 ℃條件下浸提48 h，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，再加入200 mL蒸餾水重溶，即1 g天麻可得10 mL的醇提物，用于灰樹(shù)花液體發(fā)酵培養(yǎng)。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1生物量測(cè)定

灰樹(shù)花菌體生長(zhǎng)情況以其菌絲體生物量為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。將發(fā)酵培養(yǎng)基中菌絲體經(jīng)8層紗布過(guò)濾，蒸餾水沖洗菌絲體3次后，于70 ℃數(shù)顯恒溫干燥箱中干燥，直至菌絲體恒重，記錄所得菌絲體質(zhì)量。

1.5.2胞外多糖產(chǎn)量測(cè)定

灰樹(shù)花發(fā)酵體系中胞外多糖產(chǎn)量采用苯酚- 硫酸法進(jìn)行測(cè)定[19]。發(fā)酵液超濾(截留量10 kDa)后旋轉(zhuǎn)濃縮至原體積的四分之一，再經(jīng)透析(截留量7 000 Da)后，取適量發(fā)酵液于離心管內(nèi)，加入4倍體積95%(體積分?jǐn)?shù))無(wú)水乙醇，于4 ℃條件下醇沉24 h后，6 000 r/min離心15 min，傾去上清液，沉淀加蒸餾水重溶，待測(cè)。

1.5.3香草醇含量測(cè)定

香草醇含量測(cè)定采用高效液相色譜法[20]。稱取香草醇3 mg，加入30 mL純凈水溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待測(cè)。取1.5 mL發(fā)酵液過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

檢測(cè)條件：色譜柱為Agilent TC- C18(4.6 mm×250 mm，10 μm)；流動(dòng)相為0.1%磷酸水(流動(dòng)相A)和乙腈(流動(dòng)相B)；梯度洗脫為0～35 min，體積分?jǐn)?shù)3%～30%乙腈；35～45 min, 體積分?jǐn)?shù)30%～70%乙腈；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)221 nm。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 9.0軟件繪圖，SPSS 19.0軟件分析顯著性，顯著性檢驗(yàn)采用最小顯著差數(shù)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻醇提物成分分析

課題組前期研究表明，天麻醇提物滅菌前后的主要成分含量會(huì)發(fā)生改變，尤其是天麻素同巴利森苷之間的轉(zhuǎn)化，巴利森苷是由3個(gè)天麻素分子和1個(gè)檸檬酸分子連接而成[21]。選擇滅菌后的天麻醇提物進(jìn)行香草醇含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果如圖1。由圖1可知，天麻醇提物除了含有GA、HBA及HA以外，香草醇也是天麻醇提物的主要成分，出峰時(shí)間為14 min，經(jīng)計(jì)算得滅菌后的7%天麻醇提物中香草醇含量為0.43 mg/g。

圖1 天麻醇提物和香草醇標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析Fig.1 Analysis of R. gastrodiae alcohol extract and vanillyl alcohol standard by HPLC

2.2 香草醇對(duì)菌絲體生物量和EPS產(chǎn)量的影響

為了分析香草醇對(duì)灰樹(shù)花菌絲體生物量及EPS產(chǎn)量的影響及最佳添加量，在灰樹(shù)花深層發(fā)酵體系中加入0～300 mg/L的香草醇，發(fā)酵12 d后灰樹(shù)花菌絲體生物量及EPS產(chǎn)量的變化如圖2。由圖2可知，隨著香草醇質(zhì)量濃度的增加，生物量與EPS產(chǎn)量均呈現(xiàn)出一定的先升高后降低的趨勢(shì)。這說(shuō)明一定量的香草醇可以刺激深層發(fā)酵的灰樹(shù)花菌體，有利于菌絲體的生長(zhǎng)和胞外多糖的分泌；但質(zhì)量濃度過(guò)高會(huì)抑制菌絲體的生長(zhǎng)，從而使得胞外多糖產(chǎn)量降低。當(dāng)香草醇質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，灰樹(shù)花菌絲體生物量與EPS產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為(1.47±0.02) g/L和(2.21±0.03) g/L，相較于空白組分別提高了21.1%和19.9%，且差異顯著(P<0.05)，故200 mg/L的香草醇為較佳添加量。

圖2 香草醇添加量對(duì)灰樹(shù)花菌絲體生物量 和EPS產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of vanillyl alcohol concentration on mycelial biomass and EPS production by submerged culture of G. frondosa

2.3 香草醇對(duì)發(fā)酵過(guò)程中菌絲體生物量和EPS產(chǎn)量的影響

將200 mg/L的香草醇和7%的天麻醇提物添加到灰樹(shù)花液體培養(yǎng)基中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，空白組中不加入任何外源添加物，測(cè)定天數(shù)為16 d，分析香草醇和天麻醇提物對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵過(guò)程中菌絲體生物量和EPS產(chǎn)量的促進(jìn)作用，結(jié)果如圖3。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，生物量和EPS產(chǎn)量均呈先上升后趨近于平緩的趨勢(shì)。在發(fā)酵的前4 d，灰樹(shù)花菌種處于遲滯期，菌絲體生物量和多糖產(chǎn)量均較低且增長(zhǎng)較緩慢，實(shí)驗(yàn)組和空白組多糖產(chǎn)量增加趨勢(shì)較為接近；在第5～12天，灰樹(shù)花菌種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌絲體生物量和多糖產(chǎn)量呈明顯的上升趨勢(shì)，且香草醇實(shí)驗(yàn)組明顯高于空白組，在這期間真菌灰樹(shù)花大量利用發(fā)酵體系中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，供自身生長(zhǎng)和EPS的分泌；發(fā)酵第13～16天，菌株處于穩(wěn)定期，此時(shí)菌絲體生物量和胞外多糖產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，其中第14天，香草醇和天麻醇提物實(shí)驗(yàn)組多糖合成量達(dá)到最大值，分別為(2.10±0.03) g/L和(2.39±0.03) g/L，均顯著高于空白組(P<0.05)。此外，實(shí)驗(yàn)組在第14天后多糖增加較為平緩，這可能與生長(zhǎng)環(huán)境和體系中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗有關(guān)。因此，培養(yǎng)最佳周期為14 d。本實(shí)驗(yàn)灰樹(shù)花生物量和EPS產(chǎn)量變化趨勢(shì)與Wang等[17]研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明香草醇可以顯著地促進(jìn)灰樹(shù)花菌絲體生物量和EPS的產(chǎn)生。

圖3 香草醇和天麻醇提物對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵過(guò)程中生物量和EPS產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of vanillyl alcohol and R. gastrodiae alcohol extract on mycelial biomass and EPS production during G. frondosa fermentation

2.4 發(fā)酵過(guò)程中香草醇含量變化分析

灰樹(shù)花深層發(fā)酵周期為14 d，選擇發(fā)酵第0天和第14天的發(fā)酵液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，對(duì)比峰面積，推算發(fā)酵體系中香草醇含量的變化，從而確定灰樹(shù)花對(duì)香草醇的利用率，峰面積和香草醇含量結(jié)果見(jiàn)圖4和表1。結(jié)果表明，空白組(未添加天麻醇提物)沒(méi)有檢測(cè)到香草醇成分，而實(shí)驗(yàn)組(添加7%天麻醇提物)顯示第0天和第14天的香草醇含量分別為0.41 mg/g和0.13 mg/g，降低了68.3%，這可能是香草醇作為含碳有機(jī)物被灰樹(shù)花利用，也可能是灰樹(shù)花體系中的酶將香草醇轉(zhuǎn)化為其他易于自身吸收利用的物質(zhì)。黃忠等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在灰樹(shù)花發(fā)酵周期中，天麻特征成分天麻素、對(duì)羥基苯甲醇和對(duì)羥基苯甲醛均會(huì)發(fā)生含量的變化，其中天麻素含量降低了47.86%，對(duì)羥基苯加醇降低了11.84%，對(duì)羥基苯甲醛含量降低了74.64%；結(jié)合本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)羥基苯甲醛是灰樹(shù)花能夠最有效利用的物質(zhì)，其次是香草醇、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇。香草醇利用率的確定對(duì)天麻醇提物和天麻特征成分作用于灰樹(shù)花深層發(fā)酵提供了新的理論依據(jù)。

圖4 發(fā)酵第0天和第14天香草醇的HPLC分析Fig.4 Analysis of fermentation with vanillyl alcohol at 0th day and 14th day by HPLC

2.5 天麻醇提物、香草醇、對(duì)羥基苯甲醛對(duì)菌絲體生物量及EPS產(chǎn)量的影響分析

以200 mg/L香草醇為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，同7%天麻醇提物組、150 mg/L對(duì)羥基苯甲醛組及空白組對(duì)比灰樹(shù)花菌絲體生物量及EPS產(chǎn)量差異，結(jié)果如圖5。天麻醇提物對(duì)菌絲體生物量及EPS產(chǎn)量影響最大，其次為對(duì)羥基苯甲醛和香草醇實(shí)驗(yàn)組，空白組最低。

表1 灰樹(shù)花發(fā)酵過(guò)程中香草醇含量變化Tab.1 Changes of vanillyl alcohol content during G. frondosafermentation

香草醇組的生物量為(1.40±0.02) g/L，與天麻醇提物組(1.58±0.03) g/L和對(duì)羥基苯甲醛組(1.51±0.03) g/L比較，分別降低了11.4%和7.3%，但較空白組(1.19±0.05) g/L提高了17.6%且差異顯著(P<0.05)；此外香草醇組胞外多糖產(chǎn)量為(2.28±0.02) g/L，同空白組(1.66±0.03) g/L相比，提高了37.3%且差異顯著(P<0.05)。這與吳彩云等[16]關(guān)于對(duì)羥基苯甲醛和7%天麻醇提物對(duì)灰樹(shù)花EPS生物合成促進(jìn)作用的研究結(jié)果基本一致。因此，香草醇可以促進(jìn)灰樹(shù)花菌絲體生長(zhǎng)和胞外多糖的合成，但促進(jìn)效果略低于天麻醇提物和對(duì)羥基苯甲醛。

圖5 天麻醇提物、香草醇和對(duì)羥基苯甲醛對(duì)灰樹(shù) 花生物量和EPS產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of R. gastrodiae extract, vanillyl alcohol and HA on mycelial biomass and EPS production by G. frondosa

灰樹(shù)花EPS合成與多糖合成酶作用相關(guān)，Vandamme等[23]及Wu等[24]研究表明：α-磷酸變位酶(α-phosphogluconate mutase,α-PGM)、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(phosphogluconate isomerase, PGI)、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase, UGPase)和dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶(dTDP-glucose pyrophosphorylase, AGPase)是灰樹(shù)花多糖合成途徑和糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，其中α-PGM和PGI是影響糖代謝進(jìn)入多糖合成途徑的關(guān)鍵酶，而UGPase和AGPase是影響灰樹(shù)花多糖種類和單糖構(gòu)成的關(guān)鍵酶；而Xu等[25]研究發(fā)現(xiàn),天麻醇提物提高灰樹(shù)花體系中α-PGM酶活性，降低PGI酶活力；Tang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，多糖的合成與α-PGM和PGI密切相關(guān)，其中α-PGM酶活力的提高與EPS合成呈正相關(guān)，而PGI酶活力的提高與EPS合成呈負(fù)相關(guān)，PGI酶活力提高會(huì)減少糖異生途徑(EPS合成途徑)的碳通量，不利于EPS的合成。

3 結(jié) 論

探究天麻醇提物主要成分香草醇對(duì)灰樹(shù)花深層發(fā)酵體系中菌絲體生物量及EPS產(chǎn)量的影響。通過(guò)高效液相色譜分析得出香草醇是天麻醇提物的主要成分，且灰樹(shù)花EPS產(chǎn)量達(dá)到最佳的發(fā)酵時(shí)間為14 d；第14天與第0天相比，香草醇利用率為68.3%，顯著高于對(duì)羥基苯甲醇和天麻素利用率，但低于對(duì)羥基苯甲醛的利用率。此外，當(dāng)香草醇質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，灰樹(shù)花生物量和EPS的產(chǎn)量達(dá)到最大值,分別為(1.47±0.02) g/L和(2.21±0.03) g/L，與對(duì)照組比較，分別提高了21.1%和19.9%。故香草醇對(duì)灰樹(shù)花生物量和EPS產(chǎn)量均有一定促進(jìn)作用，但由于灰樹(shù)花深層發(fā)酵的作用，香草醇的羥基是否轉(zhuǎn)化為香草醛的羰基或其他物質(zhì)，且香草醇對(duì)關(guān)鍵酶酶活力的影響同天麻醇提物相比是否存在顯著差異需要進(jìn)一步的研究。