余 靜，劉學(xué)強(qiáng)，馬俊文，李 雪，江正強(qiáng)，閆巧娟，楊紹青,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院/中國(guó)輕工業(yè)食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院， 北京 100083)

木聚糖是一類雜合多聚糖，主鏈由β-D-吡喃木糖殘基通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接，側(cè)鏈上含有不同類型的取代基團(tuán)，如α-1,2-葡萄糖醛酸基、α-L-阿拉伯呋喃糖基、O-乙?；?、4-O-甲基葡萄糖醛酸、半乳糖和阿魏酸等[1-2]。木聚糖普遍存在于植物細(xì)胞壁中[3]，如稻草、玉米芯、麥麩和甘蔗渣等多種農(nóng)業(yè)廢棄物中均含有大量天然木聚糖組分[2]。木聚糖的生物轉(zhuǎn)化是實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)資源高效開(kāi)發(fā)和利用的一個(gè)主要方向。

木聚糖酶(β-1,4-xylanase, EC 3.2.1.8)是一類能夠降解木聚糖的酶系，廣泛存在于植物、微生物、甲殼類動(dòng)物和原生動(dòng)物體中[4]。迄今，已報(bào)道的木聚糖酶大多分布在糖苷水解酶(glycoside hydrolase，GH)10家族和11家族，此外還有少數(shù)木聚糖酶分布于GH的5、7、8、30和43家族[5]。不同家族木聚糖酶在結(jié)構(gòu)、酶學(xué)性質(zhì)及適用領(lǐng)域上均存在較大差異，其中GH11家族木聚糖酶的數(shù)量相對(duì)較多(CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)迄今收錄了1 922條序列信息)。GH11家族木聚糖酶結(jié)構(gòu)大多呈現(xiàn)為單一結(jié)構(gòu)域，相對(duì)分子質(zhì)量一般小于30 kDa，最適pH值一般為酸性到中性范圍，對(duì)不同來(lái)源的木聚糖底物具有特異性，且水解產(chǎn)物主要以低聚木糖為主，單糖含量較少[5]。酸性木聚糖酶由于在酸性條件下可保持較高活性，在食品和動(dòng)物飼料等行業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景[6]：如莖點(diǎn)霉(Phomasp.)GH11家族木聚糖酶xynMF13A最適pH值為5.0，在烘焙、低聚木糖生產(chǎn)和海產(chǎn)品加工中顯示出了潛在應(yīng)用價(jià)值[7]；出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)GH11家族木聚糖酶最適pH值為4.0，該酶良好的耐酸、耐鹽和耐乙醇特性使其在果汁生產(chǎn)和釀酒行業(yè)中顯示出良好的應(yīng)用價(jià)值[8]。不同應(yīng)用領(lǐng)域?qū)δ揪厶敲傅拿笇W(xué)特性需求差別較大，因此，繼續(xù)發(fā)掘新型的、特性優(yōu)良的木聚糖酶具有重要意義。

棘孢木霉(Trichodermaasperellum)是我國(guó)2005年新發(fā)現(xiàn)的可有效抑制植物病害的木霉菌株[9]。目前已有該菌株固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的研究報(bào)道[10-12]，但是主要集中在固體發(fā)酵條件優(yōu)化等方面，尚未見(jiàn)棘孢木霉木聚糖酶基因克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)等方面的研究。本實(shí)驗(yàn)室前期篩選、鑒定并保藏了一株棘孢木霉，本研究擬從該菌基因組中克隆一個(gè)GH11家族木聚糖酶基因，并將其在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，進(jìn)一步研究重組酶的基本酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株與質(zhì)粒：棘孢木霉由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏；大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，北京博邁德生物技術(shù)公司；pET-28a(+)質(zhì)粒，含卡那霉素抗性基因、多克隆酶切位點(diǎn)以及T7啟動(dòng)子，受IPTG(異丙基硫代-β-半乳糖苷)誘導(dǎo)，美國(guó)Invitorgen公司。

真菌基因組DNA提取試劑盒，杭州倍沃醫(yī)學(xué)科技有限公司；總RNA提取試劑盒、高純質(zhì)粒制備試劑盒，北京天根生化科技有限公司；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、限制性內(nèi)切酶BamHI和NhoI、T4 DNA連接酶，大連TaKaRa公司；TransStart FastpfuDNA polymerase，北京全式金生物技術(shù)公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，AxyGen公司；Ni-NTA親和層析柱，GE公司；木糖、低聚木糖、櫸木木聚糖，Mezayme公司；樺木木聚糖、燕麥木聚糖、小麥阿拉伯木聚糖、殼聚糖、大麥β-葡聚糖、可溶性淀粉、槐豆膠、羧甲基纖維素、可德蘭多糖、pNP-β-xylopyranoside，美國(guó)Sigma公司。其他試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。

PDA平板培養(yǎng)基：200 g·L-1土豆、20 g·L-1葡萄糖、15 g·L-1瓊脂。

YPD液體培養(yǎng)基：10 g·L-1酵母浸粉、20 g·L-1蛋白胨、20 g·L-1葡萄糖。

LB液體培養(yǎng)基：5 g·L-1酵母浸粉、10 g·L-1蛋白胨、10 g·L-1NaCl。

LB平板培養(yǎng)基：5 g·L-1酵母浸粉、10 g·L-1蛋白胨、10 g·L-1NaCl、15 g·L-1瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

PB21型pH計(jì)，德國(guó)賽多利斯公司；JJT- 900型超凈工作臺(tái)，北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠；GL- 20B型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；HWS24型電熱恒溫水浴鍋、DHP- 9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HZQ- X100型恒溫雙層振蕩培養(yǎng)箱，江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；DYY- Ⅲ2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠；Power Pac Basic型電泳儀、MyCycler型PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀，美國(guó)Bio- Rad公司；TS- 1型脫色搖床，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；TU- 1800PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；JY92- ⅡN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；KTA型蛋白純化系統(tǒng)，美國(guó)GE Healthcare公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1木聚糖酶基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建

將棘孢木霉接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖瓶培養(yǎng)3 d。10 000 r·min-1離心3 min，收集0.1 g菌絲體，在研缽中加入液氮迅速研磨菌體，收集磨碎的真菌組織。使用真菌基因組DNA提取試劑盒提取棘孢木霉基因組DNA；使用總RNA提取試劑盒提取棘孢木霉總RNA，采用PolyATract mRNA Isolation Systems(Promega)方法從棘孢木霉總RNA中純化mRNA，并合成cDNA第一鏈。

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索到棘孢木霉GH11家族木聚糖酶TaXyn11A基因序列，并以此設(shè)計(jì)上下游引物。分別以棘孢木霉基因組DNA和cDNA為模板，添加上游引物TaXyn11AF(5′ CCGGAATTCGCTCCCACTGAGACCGTG 3′)和下游引物TaXyn11AR(5′ GAATGCGGCCGCTCAGCTAACGTTAATGTTTGCGTTAC 3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得編碼成熟蛋白的核酸序列。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，循環(huán)35次；最后72 ℃后延伸5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析(瓊脂糖質(zhì)量濃度為10 g·L-1)，然后切膠回收目的條帶。將PCR擴(kuò)增回收的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，和pET-28a(+)載體以BamH I和NhoI進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶連接目的基因片段和表達(dá)載體。

1.3.2木聚糖酶基因TaXyn11A序列分析

利用在線軟件SignalP4.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/signalP)分析棘孢木霉木聚糖酶信號(hào)肽編碼序列。采用NCBI BLAST(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/)進(jìn)行序列同源性比對(duì)。采用Clustal Omega(http:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進(jìn)行多重序列比對(duì)，并采用Boxshade(http:∥ww.ch.embnet.org/software/BOX-form.html/)生成多序列比對(duì)圖。

1.3.3TaXyn11A在大腸桿菌中的表達(dá)

將連接完成后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并涂布于LB平板培養(yǎng)基。挑選菌落PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子測(cè)序。取測(cè)序正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種LB液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 μg·mL-1卡那霉素)，37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期的菌液作為種子液，接種于200 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 μg·mL-1卡那霉素)，37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，30 ℃誘導(dǎo)過(guò)夜。

1.3.4重組木聚糖酶TaXyn11A的純化

重組大腸桿菌誘導(dǎo)過(guò)夜后，10 000 r·min-1離心3 min，棄上清液。用緩沖液A(20 mmol·L-1、pH值為8.0的Tris-HCl緩沖液，含500 mmol·L-1NaCl和20 mmol·L-1咪唑)重懸菌體，混合均勻后于冰水浴中超聲破碎(200 W，超聲3 s，間歇4 s，120次)。于4 ℃條件下，10 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液。

TaXyn11A的純化采用快速蛋白液相色譜純化系統(tǒng)。將粗酶液以0.5 mL·min-1的流速加載到Ni-NTA親和層析柱(1 cm×10 cm)上。上樣后依次用緩沖液A、緩沖液B(20 mmol·L-1、pH值為8.0的Tris-HCl緩沖液，含500 mmol·L-1NaCl和50 mmol·L-1咪唑)、緩沖液C(20 mmol·L-1、pH值為8.0的Tris-HCl緩沖液，含500 mmol·L-1NaCl和200 mmol·L-1咪唑)洗脫，洗脫體積均為5倍柱體積，洗脫流速均為1 mL·min-1。測(cè)定各組分的酶活力，收集有木聚糖酶活力的洗脫液，用緩沖液D(20 mmol·L-1、pH值為8.0的Tris-HCl緩沖液)4 ℃下透析6 h。

用SDS-PAGE法分析重組木聚糖酶純度。SDS-PAGE分析參照Laemmli[13]的方法進(jìn)行：分離膠體積分?jǐn)?shù)為12.5%，濃縮膠體積分?jǐn)?shù)為4.5%?？捡R斯亮藍(lán)R-250染色顯示蛋白條帶，甲醇、乙酸洗脫背景色。

1.3.5酶學(xué)性質(zhì)表征

1.3.5.1 酶活力和蛋白含量的測(cè)定

酶活力測(cè)定參照Liu等[14]的方法，并采用3,5-二硝基水楊酸(3, 5-dinitrosalicylic acid，DNS)法檢測(cè)所產(chǎn)生的還原糖量(以木糖作為標(biāo)準(zhǔn))。將100 μL適當(dāng)稀釋的酶液加入到900 μL質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的櫸木木聚糖底物中(用50 mmol·L-1、pH值為5.0的檸檬酸緩沖液配制)，50 ℃下反應(yīng)10 min，加入1 mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴15 min，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為40%的酒石酸鉀鈉溶液，最后在540 nm下測(cè)定吸光值。木聚糖酶的酶活力單位(U·mL-1)定義為每分鐘生成1 μmol木糖所需要的酶量。

蛋白含量的測(cè)定參照Liu等[14]的方法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.5.2 重組木聚糖酶分子質(zhì)量的測(cè)定

采用SDS-PAGE法檢測(cè)TaXyn11A分子質(zhì)量，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量(molecular weight，MW)的對(duì)數(shù)值(lg(MW))為縱坐標(biāo)，遷移率為橫坐標(biāo)繪圖，根據(jù)目標(biāo)蛋白遷移率計(jì)算出目標(biāo)蛋白分子質(zhì)量。標(biāo)準(zhǔn)蛋白包括溶菌酶(14.4 kDa)、大豆胰蛋白酶抑制劑(20.1 kDa)、胸苷磷酸化酶(29.0 kDa)、卵清蛋白(44.3 kDa)、牛血清白蛋白(66.2 kDa)和磷酸化酶B(97.2 kDa)。

1.3.5.3 最適pH值和酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定

1)最適pH值的測(cè)定。采用50 mmol·L-1的不同緩沖液(pH值為3.0～11.0)配制的櫸木木聚糖(10 mg·mL-1)作為底物，于50 ℃下測(cè)定木聚糖酶酶活力。以最大值為100%，分別計(jì)算不同pH值條件下的相對(duì)酶活力。

2)酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定。將稀釋后的酶液與不同pH值的緩沖液混合，40 ℃溫水浴和冰水浴下先后各處理30 min，然后在最適條件下測(cè)定殘余酶活力，以未經(jīng)處理酶液作為對(duì)照。緩沖液體系包括：檸檬酸緩沖液(pH值為3.0～6.0)、乙酸緩沖液(pH值為4.0～6.0)、MES緩沖液(pH值為5.5～6.5)、MOPS緩沖液(pH值為6.5～7.5)、磷酸緩沖液(pH值為6.0～8.0)、Tris-HCl緩沖液(pH值為7.0～9.0)、CHES緩沖液(pH值為8.0～10.0)和CAPS緩沖液(pH值為10.0～11.0)。

1.3.5.4 最適溫度和熱穩(wěn)定性的測(cè)定

1)最適溫度的測(cè)定。在30～70 ℃范圍內(nèi)，于50 mmol·L-1檸檬酸緩沖液(pH值為5.0)中測(cè)定木聚糖酶活力。以最大值為100%，分別計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活力。

2)熱穩(wěn)定性的測(cè)定。將酶液與50 mmol·L-1檸檬酸緩沖液(pH值為5.0)混合后，分別在30～60 ℃和冰水浴下先后處理30 min，然后在50 ℃下測(cè)定酶活力。以未經(jīng)處理的酶液作為對(duì)照，分別計(jì)算各溫度處理后的殘余酶活力。

3)半衰期的測(cè)定。將酶液分別于40～50 ℃保溫不同時(shí)間，用冰水浴冷卻30 min，間隔不同時(shí)間取樣，在最適條件下測(cè)定酶活力。以未經(jīng)處理的酶液作為對(duì)照計(jì)算殘余酶活力，最后通過(guò)回歸方程計(jì)算不同溫度下酶活力衰變至50%的時(shí)間。

1.3.5.5 金屬離子和化合物對(duì)酶活力影響的測(cè)定

將木聚糖酶與不同金屬離子和化合物(終濃度為1 mmol·L-1)混勻，置于40 ℃條件下保溫30 min，立即冰水冷卻30 min。以加入相同濃度金屬離子和化合物的緩沖液為空白對(duì)照，在pH值為5.0的檸檬酸緩沖液及50 ℃下測(cè)定木聚糖酶酶活力。以不加入金屬離子的酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力。

金屬離子及化合物包括：Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Ca2+、Na+、Co2+、Zn2+、K+、Ni2+、Ba2+、Cr3+、Mg2+、Ag+、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和β-巰基乙醇。

1.3.5.6 重組木聚糖酶底物特異性的測(cè)定

用50 mmol·L-1、pH值為5.0的檸檬酸緩沖液配制10 mg·mL-1不同種類聚糖和人工合成底物(pNP-β-xylopyranoside)，在50 ℃下測(cè)定酶活力。聚糖底物包括：樺木木聚糖、櫸木木聚糖、燕麥木聚糖、小麥阿拉伯木聚糖、大麥β-葡聚糖、殼聚糖、槐豆膠、可溶性淀粉、可德蘭多糖和羧甲基纖維素。以木聚糖酶對(duì)櫸木木聚糖的酶活力為100%，分別計(jì)算木聚糖酶對(duì)各種底物的比酶活力和相對(duì)酶活力。

1.3.5.7 重組木聚糖酶水解特性的測(cè)定

用50 mmol·L-1、pH值為5.0的檸檬酸緩沖液配制10 mg·mL-1的木聚糖(櫸木、樺木及燕麥木聚糖)及低聚木糖(木二糖～木五糖)底物。在底物中加入2 U·mL-1的TaXyn11A，40 ℃水浴反應(yīng)，定時(shí)取樣并用沸水煮沸5 min滅活，冷卻后離心取上清液進(jìn)行薄層層析(TLC)、高效液相色譜(HPLC)分析，以木糖和低聚木糖作為標(biāo)準(zhǔn)。TLC分析方法：展層劑為正丁醇、乙酸和水的混合液(三者體積比為2∶1∶1)，顯色劑為甲醇與濃硫酸混合液(二者體積比為95∶5)。HPLC分析方法：RID檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為35 ℃，色譜柱為氨基柱，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)為72%的乙腈，流速為0.6mL·min-1，柱溫為45 ℃，運(yùn)行時(shí)間為30 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖片處理采用Origin 8.0進(jìn)行，數(shù)據(jù)均為3次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶基因(TaXyn11A)的克隆和表達(dá)結(jié)果

圖1為木聚糖酶基因TaXyn11A的克隆與表達(dá)結(jié)果。分別以棘孢木霉基因組DNA和cDNA為模板，利用引物TaXyn11AF和TaXyn11AR，PCR擴(kuò)增木聚糖酶基因，得到長(zhǎng)度為784 bp和672 bp[圖1(a)]的片段，該基因含有1個(gè)內(nèi)含子。TaXyn11A片段經(jīng)BamHI和NhoI酶切后，與經(jīng)相同雙酶切后的載體pET-28a(+)進(jìn)行連接，構(gòu)建的重組表達(dá)載體pET-28a(+)-TaXyn11A如圖1(b)，然后將該載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

TaXyn11A編碼的木聚糖酶TaXyn11A由223個(gè)氨基酸組成，SignalP分析表明，其N端存在一個(gè)由19個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列。圖2為TaXyn11A與其他GH11家族木聚糖酶多重氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，圖2顯示，在性質(zhì)已報(bào)道的木聚糖酶中，TaXyn11A與來(lái)自哈茨木霉C4(Trichodermaharzianum)的GH11家族木聚糖酶xynⅡ(NCBI accession No. B5A7N4.1)同源性最高，為85.2%，其次為里氏木霉QM6a(Trichodermareesei，G0RUP7.1，84.8%)、桔青霉FERM P-15944(Penicilliumcitrinum，Q2PGY1.1，62.1%)和煙曲霉A1163(Aspergillusfumigatus，B0Y8Q8.1，58.7%)GH11家族木聚糖酶。此外，比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，T.harzianumC4、T.reeseiQM6a和P.citrinumFERM P-15944來(lái)源GH11家族木聚糖酶都含有兩個(gè)保守谷氨酸殘基，這些殘基可能在底物結(jié)合和催化中起關(guān)鍵作用。木聚糖酶TaXyn11A的這兩個(gè)谷氨酸殘基分別位于蛋白序列的第119和210位。

2.2 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.1重組木聚糖酶的純化及分子質(zhì)量分析

圖3為重組木聚糖酶TaXyn11A的純化結(jié)果。由圖3(a)可見(jiàn)，粗酶液采用Ni-NTA親和層析純化得到電泳級(jí)純酶。酶的純化倍數(shù)為3.2倍，酶活力回收率為70%，比酶活力由224.0 U·mg-1提高到706.0 U·mg-1。由圖3(b)可見(jiàn)，SDS-PAGE法測(cè)定TaXyn11A的分子質(zhì)量為24.2 kDa。Ezeilo等[10]利用棘孢木霉發(fā)酵油棕葉產(chǎn)木聚糖酶，在最佳發(fā)酵條件下，粗酶液中含有4個(gè)不同分子質(zhì)量的木聚糖酶，分子質(zhì)量分別為18.4、22.0、31.6、32.0 kDa。GH11家族木聚糖酶的分子質(zhì)量一般小于30 kDa，TaXyn11A的分子質(zhì)量與其他GH11家族木聚糖酶相近，如嗜熱踝節(jié)菌(Talaromycesthermophilus)木聚糖酶T-XynC(22.6 kDa)[15]、繩狀踝節(jié)菌(Talaromycesfuniculosus)木聚糖酶xynC(23.6 kDa)[16]、異宗毀絲霉(Myceliophthoraheterothallica)木聚糖酶r-ec-XylMh(24.7 kDa)[17]和宏基因組來(lái)源木聚糖酶MetXyn11(28 kDa)[18]。

2.2.2pH值對(duì)酶活力的影響

一般來(lái)說(shuō)，GH11家族木聚糖酶最適pH值為6.5～7.5[5]。圖4為pH值對(duì)TaXyn11A酶活力影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由圖4(a)可知，TaXyn11A在pH值為5.0時(shí)顯示出最大酶活力，為酸性木聚糖酶。與其他GH11家族木聚糖酶相比，該酶的最適pH值與T.funiculosus木聚糖酶xynC[16]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)木聚糖酶MxynA[19]和P.citrinum木聚糖酶[20]一致，低于M.heterothallica木聚糖酶r-ec-XylMh[17]和駱駝瘤胃宏基因組來(lái)源木聚糖酶XylCMS[21](pH值均為6.0)，但高于A.pullulans[8]木聚糖酶(pH值為4.0)。由圖4(b)可知，TaXyn11A在pH值為4.0～10.0時(shí)保溫30 min，殘余酶活力保持在80%以上，顯著優(yōu)于其他大多數(shù)GH11木聚糖酶的酸堿穩(wěn)定范圍，如MetXyn11[18](pH值為6.0～9.0)、SWT[22](pH值為4.5～7.0)和MxynA[19](pH值為4.0～8.0)。TaXyn11A較好的耐酸性和酸堿穩(wěn)定性使其在食品、飼料等行業(yè)具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

緩沖液包括檸檬酸緩沖液(■)、乙酸緩沖液(●)、MES緩沖液(◆)、MOPS緩沖液(▲)、磷酸緩沖液(▼)、Tris-HCl緩沖液(□)、CHES緩沖液(〇)和CAPS緩沖液(△)。圖4 pH值對(duì)TaXyn11A酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on activity of TaXyn11A

2.2.3溫度對(duì)酶活力的影響

大多數(shù)真菌木聚糖酶的最適溫度在45～60 ℃[8]。圖5為溫度對(duì)TaXyn11A酶活力影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖5(a)可知，TaXyn11A為中溫木聚糖酶，最適溫度為50 ℃，低于T.funiculosus木聚糖酶(55 ℃)[16]和T.asperellum木聚糖酶(60 ℃)[10]。由圖5(b)可知，TaXyn11A在45 ℃及以下保持穩(wěn)定，在45 ℃時(shí)保溫30 min能分別保持初始酶活力的87.9%，而來(lái)源于M.heterothallicaF.2.1.4的木聚糖酶r-ec-XylMh在40 ℃以下保溫30 min，僅能保持初始酶活力的72%[17]。由圖5(c)可知，TaXyn11A在40、45、50 ℃的半衰期分別為28.8 h、14.3 h、18 min，在55 ℃以上迅速失活；而來(lái)源于黑曲霉(Aspergillusniger)GH11木聚糖酶xynEV-34在45 ℃時(shí)的半衰期僅為23 min[23]。通常來(lái)說(shuō)，烘焙行業(yè)中面團(tuán)的醒發(fā)溫度為35～38 ℃[8]，因此在中溫條件下表現(xiàn)出最大酶活力的木聚糖酶可能更加適用于烘焙行業(yè)。

圖5 溫度對(duì)TaXyn11A酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on activity of TaXyn11A

2.2.4金屬離子和化合物對(duì)TaXyn11A酶活力的影響

1 mmol·L-1的EDTA、Mn2+和Cr3+對(duì)TaXyn11A的活性有激活作用，分別使其比酶活力提升了19%、14%和10%。SDS和CTAB處理對(duì)該酶酶活力有明顯抑制作用，分別使其喪失88%和61%的比酶活力。除此之外，其他金屬離子及化合物對(duì)該酶的影響較為微弱。其他大多數(shù)已報(bào)道的GH11家族木聚糖酶活性都被SDS強(qiáng)烈抑制，如木聚糖酶MetXyn11等[18]。

2.2.5TaXyn11A的底物特異性分析

TaXyn11A的底物特異性分析結(jié)果如表1。表1顯示：在測(cè)定的11種底物中，TaXyn11A只能降解木聚糖底物，對(duì)大麥β-葡聚糖、殼聚糖、槐豆膠、可溶性淀粉、可德蘭多糖、羧甲基纖維素等其他天然底物均沒(méi)有表現(xiàn)出水解活性。TaXyn11A水解燕麥木聚糖的比酶活力最高(989.6 U·mg-1)，其后依次為小麥阿拉伯木聚糖(727.6 U·mg-1)、櫸木木聚糖(706.0 U·mg-1)和樺木木聚糖(484.5 U·mg-1)。T.thermophilus來(lái)源木聚糖酶T-XynC對(duì)燕麥木聚糖(861.91 U·mg-1)的水解能力也高于櫸木木聚糖(549.88 U·mg-1)和樺木木聚糖(519.71 U·mg-1)[15]。此外，TaXyn11A對(duì)人工底物對(duì)硝基苯-β-D-木吡喃糖苷沒(méi)有水解活性，說(shuō)明該木聚糖酶可能不具有β-木糖苷酶活性。

表1 TaXyn11A的底物特異性Tab.1 Substrate specificity of TaXyn11A

2.2.6TaXyn11A的水解特性分析

M：木糖和低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)品(X.木糖；X2.木二糖；X3.木三糖；X4.木四糖；X5.木五糖；X6.木六糖)。圖6 TaXyn11A水解木聚糖和低聚木糖產(chǎn)物TLC分析結(jié)果Fig.6 TLC analysis of hydrolysis products of xylans and xylooligosaccharides by TaXyn11A

大多數(shù)GH11家族木聚糖酶水解木聚糖的產(chǎn)物中以低聚木糖為主，單糖含量相對(duì)較少。TaXyn11A水解特性分析結(jié)果見(jiàn)圖6。圖6(a)和圖6(b)表明：TaXyn11A水解櫸木木聚糖和樺木木聚糖時(shí)，反應(yīng)初始15 min，產(chǎn)物主要為聚合度(degree of polymerization，DP)六以上的低聚木糖，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，這些低聚木糖分子逐步被水解為DP更低的低聚木糖；水解12 h后，櫸木木聚糖的產(chǎn)物主要為木二糖(3.42 mg·mL-1)、木三糖(0.60 mg·mL-1)、木五糖和木六糖，此外還含有少量木糖(0.17 mg·mL-1)，而樺木木聚糖的水解產(chǎn)物主要為木二糖～木六糖，其中木二糖～木四糖的質(zhì)量濃度分別為2.15、0.82、0.20 mg·mL-1。櫸木木聚糖和樺木木聚糖主鏈的木糖殘基被4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸或D-葡萄糖醛酸部分取代(取代率約為13%)，因此，水解產(chǎn)物中木五糖和木六糖可能是帶有葡萄糖醛酸側(cè)鏈的低聚木糖。由圖6(c)可知：TaXyn11A水解燕麥木聚糖的產(chǎn)物主要為聚合度2～5的低聚木糖，其中木二糖～木四糖的質(zhì)量濃度分別為0.56、0.40、0.56 mg·mL-1，產(chǎn)物中的木五糖可能帶有L-阿拉伯呋喃糖殘基[24]。其他GH11家族木聚糖酶具有相似的水解特性，例如：Wu等[15]用T.thermophilus來(lái)源木聚糖酶水解樺木木聚糖，水解產(chǎn)物以木二糖～木六糖為主，水解燕麥木聚糖的產(chǎn)物主要為木二糖～木五糖；產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonasflavigena)GH11家族木聚糖酶CFXyl3水解櫸木木聚糖產(chǎn)物為木二糖～木六糖[25]。TaXyn11A不能水解木二糖和木三糖[圖6(d)]，但可以水解木四糖和木五糖[圖6(e)和圖6(f)]，且水解產(chǎn)物以木二糖和木三糖為主，即僅有兩個(gè)木糖基團(tuán)和3個(gè)木糖基團(tuán)主鏈的低聚木糖不能被該酶水解，有4個(gè)及以上木糖基團(tuán)的低聚木糖主鏈存在時(shí)該酶才可以作用，因此推測(cè)該酶的最小水解底物是木四糖。

3 結(jié) 論

從棘孢木霉基因組中克隆得到一個(gè)GH11家族酸性木聚糖酶基因(TaXyn11A)，該基因編碼的蛋白質(zhì)同一些已報(bào)道的GH11家族木聚糖酶氨基酸序列同源性較高，其中，與哈茨木霉的木聚糖酶xynⅡ同源性為85.2%。該基因在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，純酶分子質(zhì)量為24.2 kDa，對(duì)燕麥木聚糖的比酶活力達(dá)到989.6 U·mg-1。重組木聚糖酶TaXyn11A具有良好的耐酸性，最適反應(yīng)pH值為5.0，在pH值為4.0～10.0時(shí)保持穩(wěn)定。TaXyn11A無(wú)纖維素酶活性，能特異性水解燕麥木聚糖、小麥阿拉伯木聚糖、櫸木木聚糖和樺木木聚糖底物，并產(chǎn)生聚合度為2～6的低聚木糖，該酶在食品、飼料、低聚木糖等的生產(chǎn)中具有潛在的應(yīng)用前景。