歐麗娟，安學(xué)忠，羅建新，王凌云，薄 恒，孫愛(ài)明，陳蘭蘭

湖南工學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院, 湖南 衡陽(yáng) 421002

引 言

汞是一種具有生物累積、食物鏈放大和高毒性的重金屬離子污染物，不易降解，且環(huán)境污染持久[1]。即便少量存在于環(huán)境中，也會(huì)給環(huán)境和人類(lèi)健康帶來(lái)極大的威脅。研究表明，少量的汞暴露會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、造血系統(tǒng)、肝臟等各方面的疾病[2]。研究發(fā)展高靈敏、高選擇性的汞檢測(cè)手段在環(huán)境監(jiān)測(cè)和生命科學(xué)領(lǐng)域具有極為重要的意義。

傳統(tǒng)的檢測(cè)汞離子的方法有原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法等。這些方法大都依賴(lài)大型精密貴重儀器，需專(zhuān)業(yè)人員操作，且操作步驟繁瑣費(fèi)時(shí)。近年來(lái)，發(fā)展了一系列新的熒光技術(shù)用于汞離子的檢測(cè)，如半導(dǎo)體量子點(diǎn)、有機(jī)熒光分子等[3-4]。這些方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)汞離子高靈敏度、高效率的檢測(cè)。但是，這些熒光分子合成步驟復(fù)雜耗時(shí)，或使用到有毒物質(zhì)。因此，尋找一種快速、簡(jiǎn)單且安全的方法檢測(cè)汞離子非常有意義。

貴金屬納米簇(金納米簇、銀納米簇、鉑納米簇、銅納米簇)由于具有優(yōu)異的熒光性質(zhì)、較低的毒性和良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于疾病診斷、細(xì)胞成像、環(huán)境監(jiān)測(cè)和生物傳感等領(lǐng)域[5-6]。其中，金納米簇因其優(yōu)良的光學(xué)穩(wěn)定性、光學(xué)催化性質(zhì)備受科學(xué)研究者的青睞。有報(bào)道以牛血清蛋白(BSA)為穩(wěn)定劑和還原劑[7]，合成發(fā)紅光的金納米簇(BSA-AuNCs)，并用于汞離子的檢測(cè)。有研究[8]合成了強(qiáng)熒光的谷胱甘肽(GSH)包覆的金納米簇檢測(cè)汞離子。蔡宇玲等[9]利用GSH-AuNCs構(gòu)建紙型便攜式器件實(shí)現(xiàn)對(duì)汞離子的可視化分析。最近，Wang等[10]發(fā)現(xiàn)，富含腺嘌呤(A)的單鏈DNA可以作為合成金納米簇的模板(聚A-金納米簇)。相對(duì)于以生物大分子為模板合成的金納米簇，聚A-金納米簇制備過(guò)程簡(jiǎn)單，快速，僅需30 min(BSA-AuNCs[7]： 12 h/GSH-AuNCs[8-9]： 24 h)，且熒光強(qiáng)度可以通過(guò)聚A鏈DNA的長(zhǎng)度來(lái)調(diào)節(jié)?；诰跘-金納米簇的超小尺寸、優(yōu)良的熒光性能、良好的光學(xué)穩(wěn)定性、合成簡(jiǎn)單，聚A-金納米簇成功應(yīng)用于對(duì)蛋白質(zhì)、小分子和核酸等物質(zhì)的檢測(cè)[10-12]。

本文提出了一種檢測(cè)Hg2+的新方法。利用富含腺嘌呤(A)的單鏈DNA為模板合成的金納米簇作為熒光探針，由于Hg2+和金強(qiáng)烈的親和作用，導(dǎo)致金納米簇?zé)晒庑盘?hào)猝滅。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

A15寡聚核苷酸鏈購(gòu)自上海生工生物工程公司。硝酸汞購(gòu)自上海百靈威科技有限公司。檸檬酸鈉、氯金酸(HAuCl4)由北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司提供。所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用超純水(電阻大于18. 25 MΩ)。

Cary Eclipse 熒光分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫公司)，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為280 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別設(shè)定為5.0和10.0 nm。

1.2 熒光金納米簇的合成

聚腺嘌呤-金納米簇的制備參照文獻(xiàn)[10]略有修改： 將600 nmol·L-1的A15-ssDNA溶液、2 mmol·L-1檸檬酸鈉(pH 6.0)、50 μmol·L-1HAuCl4加入到離心管中，然后加超純水補(bǔ)充體積至1 mL。室溫下混勻后，將混合物置于85 ℃下孵育30 min，即可得到熒光金納米簇。制備好的金納米簇置于4 ℃冰箱中避光儲(chǔ)存，以備實(shí)驗(yàn)使用。

1.3 汞離子的檢測(cè)

在200 μL反應(yīng)體系中，將不同濃度的硝酸汞溶液加入到10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)和100 μL制備好的金納米簇溶液中，混勻后，即可測(cè)定熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

檢測(cè)汞離子的實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。根據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道，金與腺嘌呤N7位上的氮原子具有強(qiáng)烈的親和作用。本文選擇聚A單鏈DNA作為模板，HAuCl4為金源，以檸檬酸鈉為還原劑。在pH為6的條件下，Au3+被檸檬酸鈉還原成Au0，并富集在A15單鏈DNA上，形成具有強(qiáng)熒光的單鏈金納米簇。當(dāng)汞離子存在時(shí)，可以有效地猝滅金納米簇的熒光。這可能是由于以Poly A為模板合成金納米簇的過(guò)程中，產(chǎn)生了中間體Au+。Hg2+與Au+之間強(qiáng)烈的噬金屬作用，破壞了金納米簇的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致金納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度降低。

圖1 基于A15-ssDNA金納米簇檢測(cè)Hg2+的原理圖Fig.1 Schematic representation of a Hg2+ sensor based on A15-ssDNA AuNCs

2.2 金納米簇的表征及熒光響應(yīng)行為

圖2(a)是A15-ssDNA金納米簇的透射電子顯微鏡(TEM)照片合成的金納米簇為球形，分散性良好，平均粒徑大約為7 nm。圖2(b)是金納米簇的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。如圖5所示，金納米簇在280 nm的紫外光激發(fā)下，在471 nm處出現(xiàn)強(qiáng)的熒光發(fā)射峰。圖2(c)是汞離子存在與否的熒光發(fā)射光譜圖。曲線(xiàn)a是A15-ssDNA金納米簇的熒光光譜，可以看出在471 nm有一強(qiáng)的熒光發(fā)射峰。加入50 μmol·L-1的Hg2+后，金納米簇的熒光被有效猝滅(曲線(xiàn)b)，說(shuō)明Hg2+與金納米簇存在強(qiáng)烈的相互作用，金納米簇的熒光被猝滅。以上結(jié)果表明，利用金納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的變化檢測(cè)汞離子的方法是可行的。

圖2 (a) DNA-AuNCs的電鏡照片; (b) DNA-AuNCs的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜; (c) DNA-AuNCs的熒光光譜 a： AuNCs； b： AuNCs+Hg2+Fig.2 (a) TEM images of DNA-AuNCs; (b) The Fluorescence excitation and emission spectra of AuNCs; (c) Fluorescence emission spectra of AuNCs under different conditions a： AuNCs； b： AuNCs+Hg2+

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

圖3(a)反映了不同pH值的緩沖溶液對(duì)傳感器性能的影響。由圖可知，緩沖溶液的pH值對(duì)不加汞離子(a)與加汞離子(b)的金納米簇的熒光強(qiáng)度影響不大。但是pH值為7時(shí)背景略低于其他的pH值。故選取pH值為7作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的緩沖體系。

實(shí)驗(yàn)還考察了Hg2+與金納米簇反應(yīng)所需的時(shí)間。從圖3(b)可知，當(dāng)加入20 μmol·L-1Hg2+至金納米簇溶液中，熒光強(qiáng)度在1 min之內(nèi)迅速下降并趨于平緩。說(shuō)明Hg2+與金納米簇反應(yīng)非常迅速。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，僅需將溶液簡(jiǎn)單混合均勻后，即可進(jìn)行熒光檢測(cè)。

圖3 (a)緩沖溶液pH的優(yōu)化： (a) AuNCs； (b) AuNCs+Hg2+； (b)反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化Fig.3 (a) Effects of the pH in the absence (a) and presence of Hg2+ (b)； (b) Effects of the reaction time

2.4 傳感器的分析性能

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)0.01～50 μmol·L-1范圍內(nèi)的Hg2+進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖4(a)所示。由圖可知，隨著Hg2+濃度的增大，金納米簇的熒光強(qiáng)度逐漸降低。圖4(b)為471 nm處熒光強(qiáng)度與Hg2+濃度的校正曲線(xiàn)圖(F0與F分別為不加汞離子與加汞離子的金納米簇的熒光強(qiáng)度)。由圖可知，熒光強(qiáng)度和Hg2+濃度在0.01～1 μmol·L-1范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，用空白的三倍標(biāo)準(zhǔn)偏差原則確定檢測(cè)下限為3 nmol·L-1。該方法檢測(cè)Hg2+的靈敏度比之前文獻(xiàn)[14-16]報(bào)道的熒光傳感器的靈敏度高。

圖4 (a)不同Hg2+濃度對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射光譜圖(從上至下： 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 2, 5, 10, 20, 50 μmol·L-1); (b)熒光強(qiáng)度與Hg2+濃度的線(xiàn)性關(guān)系, 插圖： 校正曲線(xiàn); (c)選擇性考察，Hg2+： 20 μmol·L-1； 其他金屬離子： 50 μmol·L-1

表1 自來(lái)水中Hg2+檢測(cè)的加標(biāo)回收率Table 1 Recovery of the biosensor for determinationof Hg2+ in tap water samples

為了證明該方法對(duì)Hg2+檢測(cè)的特異性，實(shí)驗(yàn)選用其他可能產(chǎn)生干擾的金屬離子進(jìn)行了考察，如Cu2+，Mg2+，Ca2+，K+，Pb2+，Mn2+，Ag+，F(xiàn)e3+。從圖4(c)中可以明顯看出，只有Hg2+的加入導(dǎo)致金納米簇的熒光信號(hào)顯著降低，其他金屬離子的加入對(duì)金納米簇的熒光信號(hào)并無(wú)明顯影響。說(shuō)明該方法對(duì)Hg2+的檢測(cè)具有高選擇性。

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定了自來(lái)水樣中加入的Hg2+。由表1可知，Hg2+的加標(biāo)回收率在95.33%～103.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于4%。表明該方法具有很好的可靠性和準(zhǔn)確性，可用于實(shí)際樣品中Hg2+的檢測(cè)。

3 結(jié) 論

以A15-ssDNA金納米簇為熒光探針，基于Hg2+與納米金強(qiáng)烈的親和作用，從而猝滅金納米簇?zé)晒猓O(shè)計(jì)了一種新型的、快速的、非標(biāo)記的傳感策略用于汞離子的高靈敏性和高選擇性檢測(cè)。作為熒光探針，A15-ssDNA金納米簇?fù)碛辛己玫纳锛嫒菪?、?yōu)異的熒光性能和光學(xué)穩(wěn)定性。同時(shí)，該方法僅需將溶液簡(jiǎn)單的混合，操作簡(jiǎn)單、快速。此外，該方法在0.01～1 μmol·L-1之間可以高靈敏的檢測(cè)汞離子，檢測(cè)下限達(dá)到3 nmol·L-1，且方法的選擇性好，可以滿(mǎn)足對(duì)實(shí)際樣品中Hg2+的檢測(cè)需求。