彭 程，劉 朔，張 琳，2，李金平，于曉慧，侯廣宇，王靜靜，李 陽，蔣文明，劉華雷

（1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271000）

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV），屬于正黏病毒科A 型流感病毒屬，可引起禽類和哺乳動(dòng)物的高度傳染性呼吸道疾病[1]。根據(jù)其致病性不同和HA 蛋白裂解位點(diǎn)處的分子特征，可將AIV 分為高致病性禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）和低致病性禽流感 病 毒（low pathogenic avian influenza virus，LPAIV）[2-3]，其中HPAIV 主要包括H5 和H7 亞型，引起的高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI）不僅嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展，亦嚴(yán)重威脅人類健康，因而被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報(bào)動(dòng)物疫病，在我國被列為一類動(dòng)物疫病。

自A/goose/Guangdong/1/1996（H5N1）HPAIV 報(bào)道以來，全球H5 亞型HPAIV 暴發(fā)數(shù)逐漸增多，病毒也進(jìn)化為10 個(gè)分支，內(nèi)部超過30 個(gè)亞分支[4-5]。在H5 亞型HPAIV 中，第2.3.4.4 分支和第2.3.2.1 分支病毒在亞洲地區(qū)（如中國、越南、韓國等）家禽中呈地方性流行[6-7]。第2.3.2.1 分支于2004 年首次在香港發(fā)現(xiàn)，之后病毒逐漸進(jìn)化為2.3.2.1a、2.3.2.1b、2.3.2.1c、2.3.2.1d 和2.3.2.1e 等5 個(gè)小分支[8-9]。第2.3.4.4 分支病毒在亞洲、北美、歐洲、非洲等地區(qū)暴發(fā)和流行[10-12]。近年來，我國流行的H5 亞型HPAIV 為第2.3.2.1 和第2.3.4.4 分支，且這兩個(gè)分支病毒具有不同的抗原特性，對(duì)應(yīng)的疫苗毒株也不同。因此，臨床上需要對(duì)H5 亞型HPAIV 進(jìn)行快速準(zhǔn)確診斷和分支區(qū)分。

分子診斷是鑒定和控制HPAI 疫情的第一步。當(dāng)前，許多實(shí)驗(yàn)室建立了多種診斷方法，如DNA芯片、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法以及限制性片段長度多態(tài)性分析等[13-16]，用來快速區(qū)分HA 亞型，其中最常用的是實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 方法。這些方法雖然可以對(duì)病毒進(jìn)行亞型鑒定，但不能進(jìn)行分支鑒定，還需要通過測(cè)序等技術(shù)進(jìn)一步分析。因此有必要發(fā)展一種快速診斷方法，可以同時(shí)檢測(cè)不同分支的H5亞型HPAIV[17]。

本研究建立了一種可以在檢測(cè)H5 亞型HPAIV的同時(shí)鑒別其所屬分支的一步法雙重實(shí)時(shí)熒光RTPCR 方法。該方法檢測(cè)耗時(shí)短，且可快速做出結(jié)果及其所屬分支判斷，對(duì)禽流感快速診斷及控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

QIAamp Viral RNA Mini Kit核酸提取試劑盒，購自Qiagen 公司；HiScript II U+One Step qRT-PCR Probe Kit，購自Vazyme 公司；TOPO 載體克隆試劑盒，購自CloneSmart 公司。

1.2 病毒和核酸提取

各亞型AIV、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）、傳染性喉氣管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus，ILTV）以及雞星狀病毒（chicken astrovirus，CAstV），均由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國家禽流感專業(yè)實(shí)驗(yàn)室分離及保存。按照操作說明書，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取上述病毒RNA。

1.3 引物和探針設(shè)計(jì)

對(duì)GenBank 和GISAID 數(shù)據(jù)庫中發(fā)表的以及本實(shí)驗(yàn)室分離保存的H5 亞型禽流感病毒HA 基因序列進(jìn)行比對(duì)及構(gòu)建進(jìn)化樹，針對(duì)分屬于2.3.2.1分支及2.3.4.4 分支的HA 核苷酸序列，在其共同保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，在兩個(gè)分支的特異性區(qū)域分別設(shè)計(jì)探針，并對(duì)多條引物、探針進(jìn)行組合及檢驗(yàn)，從而篩選出最優(yōu)引物和探針。

1.4 反應(yīng)體系和條件

配制體系為20 μL 的熒光定量RT-PCR 反應(yīng)液：在反應(yīng)體系中依次加入2×One Step U+Mix 10.0 μL，RNase Free H2O 3.8 μL，引物H5-301F、H5-498R、2321P3、2344P 各0.8 μL（10 μmol/L），One Step U+Enzyme Mix 1.0 μL，最后加入RNA 模板2 μL。RT-PCR 反應(yīng)條件設(shè)置為：55 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，95 ℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增（95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s，在此時(shí)收集熒光信號(hào)）。

1.5 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 方法優(yōu)化

對(duì)反應(yīng)體系中的不同引物和探針濃度組合（引物1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 μmol/L，探 針1.0、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 μmol/L），反應(yīng)體積（50、20 μL）及擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)（反轉(zhuǎn)錄5、10、15 min，退火延伸20、30 s）等反應(yīng)條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化，以達(dá)到最優(yōu)組合。

1.6 特異性試驗(yàn)

采用上述優(yōu)化后的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，分別檢測(cè)H1、H2、H3、H4、H5（2.3.2.1 分支）、H5（2.3.4.4 分支）、H6、H7、H9、H10、H11 亞型AIV，以及NDV、IBV、ILTV、CAstV 等常見禽類病毒，檢驗(yàn)該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)

使用上述引物分別對(duì)第2.3.2.1 分支和第2.3.4.4 分支的H5 亞型陽性毒株RNA 進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的RT-PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析后進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)測(cè)序結(jié)果比對(duì)，證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物為H5 亞型HA 基因序列，然后將RT-PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接TOPO 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒TOPO-1923（2.3.2.1 分支） 和TOPO-G1778mH1（2.3.4.4 分支）。將重組質(zhì)粒經(jīng)核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定濃度后，先分別稀釋1 000 倍，再依次10 倍梯度稀釋至10-10，分別取2 μL 作為反應(yīng)模板，并做3 個(gè)重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)，將所能檢測(cè)到的最高稀釋濃度換算成拷貝數(shù)。計(jì)算公式為：DNA copies/μL=[6.02×1023×最低檢測(cè)濃度（ng/μL）×10-9]/（DNA堿基數(shù)×660）。

1.8 臨床樣品檢測(cè)

利用上述建立的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 方法，對(duì)2020 上半年采集自某市3 個(gè)場點(diǎn)的100 份家禽（雞、鴨）咽喉和泄殖腔雙拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果與普通RT-PCR 檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較，檢驗(yàn)該方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 方法的建立及優(yōu)化

利用本實(shí)驗(yàn)室保存的H5 亞型AIV 毒株進(jìn)行多次驗(yàn)證，篩選出最適合的引物和探針（表1）。探針2321P3（針對(duì)2.3.2.1 分支）5'端標(biāo)記HEX，3'端標(biāo)記MGB；探針2344P（針對(duì)2.3.4.4 分支）5'端標(biāo)記Cy5，3'端標(biāo)記BHQ2。

表1 最適引物及探針序列

在雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 反應(yīng)體系中，通過對(duì)不同引物和探針的濃度組合、反應(yīng)體積及擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)等條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化，建立了可鑒別H5 亞型AIV 不同分支的雙重?zé)晒釸T-PCR 檢測(cè)方法。經(jīng)過反復(fù)優(yōu)化及驗(yàn)證，確定該雙重實(shí)時(shí)熒光RTPCR 檢測(cè)方法的最適反應(yīng)體積為20 μL（其中模板2 μL），最適引物和探針濃度均為0.4 μmol/L；最佳反應(yīng)條件為55 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，95 ℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增（95 ℃ 10 s；60 ℃30 s，在此時(shí)收集熒光信號(hào)）。試驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)Ct 值及熒光曲線判定結(jié)果：Ct ≤32，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，樣品判為陽性；無典型的擴(kuò)增曲線并且無Ct 值，樣品判為陰性；32 ＜Ct ≤36，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判為疑似樣品，需進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。

2.2 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 方法特異性

特異性檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，僅2.3.2.1 分支及2.3.4.4 分支的H5 亞型AIV 出現(xiàn)了正常的熒光擴(kuò)增曲線，對(duì)其他亞型AIV 及其他禽類病毒擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，表明該方法具有良好的特異性。

圖1 H5 亞型AIV 不同分支雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 方法特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 方法敏感性

敏感性檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，該雙重?zé)晒舛縍T-PCR 方法對(duì)于2.3.2.1 分支H5 亞型AIV，檢測(cè)的最高稀釋度為10-8，換算成拷貝數(shù)為495.0 copies/μL；對(duì)于2.3.4.4 分支H5 亞型AIV，檢測(cè)的最高稀釋度為10-9，換算成拷貝數(shù)為22.3 copies/μL。

2.4 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)100 份臨床樣品檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽性樣品13 份，均為2.3.4.4 分支的H5 亞型AIV。對(duì)這些樣品同時(shí)應(yīng)用普通RT-PCR 及病毒分離方法檢測(cè)，并送青島睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)及分析，與上述雙重?zé)晒鈱?shí)時(shí)定量RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果符合率為100%（圖3）。

3 討論

圖2 H5 亞型AIV 不同分支雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果

圖3 H5 亞型AIV 不同分支雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 方法臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

近幾年，世界各地報(bào)告的HPAI 疫情均以H5亞型為主[18-21]。其中：2018 年世界范圍內(nèi)所報(bào)道的HPAI 疫情中，H5 亞型疫情比例高達(dá)99.1%；OIE 數(shù)據(jù)顯示，2019 年H5 亞型疫情占總HPAI 疫情總數(shù)的85.8%。我國自1996 年首次分離到H5亞型HPAIV 至今，多個(gè)省份暴發(fā)過H5 亞型疫情，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[22-23]。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部官網(wǎng)信息，我國在2019 年發(fā)生的4 起HPAI 疫情中，3 起為H5 亞型，比例高達(dá)75%，其中2 起由第2.3.4.4 分支引起，1 起由第2.3.2.1 分支引起。

據(jù)本實(shí)驗(yàn)室調(diào)查，2015 年以來，我國流行的H5 亞型HPAIV 主要為第2.3.2.1 分支和第2.3.4.4分支，其中以第2.3.4.4 分支為主，第2.3.2.1 分支引起的疫情偶有發(fā)生。2015 年之后，已連續(xù)6 年未檢測(cè)到第7 分支的病毒。

為了有效監(jiān)測(cè)和控制H5 亞型HPAIV 的傳播，許多實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了相關(guān)診斷技術(shù)，如病毒分離、普通RT-PCR、傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 等[24]。病毒分離是流感病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是該方法耗時(shí)、費(fèi)用高，不適合多亞型HPAIV 的鑒別。普通RT-PCR 檢測(cè)耗時(shí)長，且具有開放操作環(huán)節(jié)，容易對(duì)周圍環(huán)境造成污染。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 具有較高的敏感性和特異性，可用于病毒亞型鑒定，被廣泛用于臨床診斷[25]。為了檢測(cè)和區(qū)分H5 亞型HPAIV，一些實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了多重實(shí)時(shí)熒光RTPCR 方法[24，26-27]。然而，這些方法由于存在非特異性的交叉反應(yīng)等缺陷，檢測(cè)的特異性和敏感性較低[27]。

本研究篩選出的特異性引物和探針，可以對(duì)臨床樣品中的第2.3.4.4 分支和第2.3.2.1 分支病毒進(jìn)行區(qū)分鑒別。這種一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 方法可以同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分兩個(gè)分支的病毒且無交叉反應(yīng)。為了提高靶基因檢測(cè)的特異性，在2 個(gè)分支病毒的共同保守區(qū)設(shè)計(jì)了1 對(duì)引物，對(duì)不同分支各自的保守區(qū)設(shè)計(jì)探針。13 份H5 亞型HPAIV 陽性樣品的Ct 值介于20～30。此外，所有使用本方法檢測(cè)為H5 陽性的樣品均經(jīng)過測(cè)序并BLAST 驗(yàn)證正確。本研究建立的可同時(shí)鑒別H5 亞型HPAIV 所屬分支的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)方法，經(jīng)驗(yàn)證與其他亞型AIV 及常見禽病病毒無交叉反應(yīng)，且具有快速、特異、敏感和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于當(dāng)前H5 亞型HPAIV 的快速檢測(cè)和分支鑒別，對(duì)于HPAIV 的診斷和控制具有較高的臨床使用價(jià)值。