高 峰，單衡明，秦志軍，張 丹，張 琳，王世軍，胡英明

（1.鹽城海關(guān)，江蘇鹽城 224002；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），俗稱“豬藍(lán)耳病”，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起，主要表現(xiàn)為不同年齡段豬只的呼吸道綜合征、發(fā)熱、出血，以及母豬流產(chǎn)和產(chǎn)弱仔、死胎或木乃伊胎為特征的繁殖障礙。PRRS 在美國(guó)已流行30 多年，在我國(guó)已流行20 多年，長(zhǎng)期以來(lái)一直是一種經(jīng)濟(jì)意義重大的流行疾病[1]。PRRSV 基因組長(zhǎng)約15 kb，包含11 個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），至少有14 種非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP）。NSP2 區(qū)30 個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失被認(rèn)為是我國(guó)高致病性PRRSV（HP-PRRSV）毒株的分子特征。目前PRRSV 普遍存在于國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)。Peng 等[2]的調(diào)查結(jié)果顯示，2012—2015 年我國(guó)29 個(gè)省PRRSV 檢出率分別為45.67%、55.99%、56.91% 和59.07%。Xie 等[3]于2017—2018 年在我國(guó)27 個(gè)省2 428 個(gè)豬場(chǎng)的流行病學(xué)調(diào)查顯示，不同地區(qū)的PRRSV 檢測(cè)陽(yáng)性率為8.12%～29.33%。Guo 等[4]從分子流行病學(xué)角度，系統(tǒng)分析了我國(guó)PRRSV 流行狀況，發(fā)現(xiàn)PRRSV-1和PRRSV-2 都在傳播，約80%以上的豬場(chǎng)存在PRRSV 血清陽(yáng)性。其中PRRSV-2 有4 個(gè)譜系（譜系1、3、5、8）在田間循環(huán)。

PRRS 檢測(cè)和疫苗免疫在其臨床防控中起著重要作用。PRRS 檢測(cè)技術(shù)有很多，其中最主要的是血清抗體ELISA 以及各種類型的PCR 檢測(cè)技術(shù)。每種檢測(cè)技術(shù)的目的有所不同，涉及調(diào)查疫苗免疫效率、野毒感染情況、野毒類型以及診斷病例等，市場(chǎng)上的疫苗也有不同類型的單苗及聯(lián)苗可供選擇，因此如何選擇合適的檢測(cè)技術(shù)以及合適的疫苗進(jìn)行PRRS 綜合防控具有現(xiàn)實(shí)意義。本文就PRRS檢測(cè)技術(shù)和疫苗研發(fā)進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為臨床PRRS 綜合防控提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

近年來(lái)，PRRS 疫苗免疫以及PRRSV 感染十分普遍。診斷PRRS 首先要看流行病學(xué)特點(diǎn)和臨床癥狀。豬群感染PRRSV 后，由于毒株不同、日齡不同、環(huán)境差別等，表現(xiàn)出不同的臨床癥狀：母豬以繁殖障礙為主，主要表現(xiàn)懷孕母豬出現(xiàn)大批量流產(chǎn)或早產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎以及弱仔增多；后備母豬表現(xiàn)發(fā)情率低、屢配不孕、空懷比例高等。除繁殖障礙外，母豬也會(huì)出現(xiàn)呼吸道癥狀及發(fā)熱，表現(xiàn)為體溫升高、呼吸困難、咳嗽，同時(shí)表現(xiàn)厭食等，陰唇和耳部等末梢部位呈藍(lán)色或藍(lán)紫色。仔豬表現(xiàn)為嚴(yán)重的呼吸道疾病，主要為呼吸困難、咳嗽、同時(shí)表現(xiàn)食欲廢絕、高燒，嚴(yán)重的還會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)失調(diào)，其中哺乳仔豬死亡率較高，可高達(dá)80%左右。育肥豬主要表現(xiàn)為一過(guò)性厭食、輕度呼吸困難、咳嗽、發(fā)熱、皮膚發(fā)紅等[5-7]。但很多時(shí)候PRRSV 的感染過(guò)程是亞臨床的，因此有必要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)來(lái)檢測(cè)病毒或特異性抗體。加之我國(guó)境內(nèi)已存在多種毒株，各種年齡的豬均可發(fā)病，且病情、癥狀差異較大，極易與豬附紅細(xì)胞體病、豬瘟、豬支原體肺炎等混淆[8]。除此之外，持續(xù)監(jiān)測(cè)PRRSV 流行株的流行病學(xué)和遺傳特征，有利于預(yù)防和控制其感染。所以對(duì)PRRSV 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)越來(lái)越至關(guān)重要。PRRSV 的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)最主要的有血清學(xué)和分子生物學(xué)兩種。

1.1 血清學(xué)檢測(cè)

盡管國(guó)內(nèi)規(guī)?；i場(chǎng)普遍使用滅活疫苗和弱毒活疫苗來(lái)預(yù)防PRRS，但疫苗免疫后的抗體水平參差不齊?？贵w水平是反映群體PRRSV 感染與否或免疫是否合格的重要指標(biāo)。目前，PRRSV 的血清抗體檢測(cè)技術(shù)相對(duì)比較成熟，已經(jīng)有很多商品化試劑盒，比如美國(guó)的IDEXX、韓國(guó)的金諾以及國(guó)內(nèi)的科前、維德維康等。但各家的試劑盒在敏感性和特異性上都有一些差別。Biernacka 等[9]對(duì)比了IDEXX（美國(guó)）、Hipra（西班牙）、Ingenasa（西班牙）、Qiagen（德國(guó)）、BioNote（韓國(guó)）以及ThermoFisher（美國(guó)）等 6 個(gè)商品化PRRSV 抗體檢測(cè)試劑盒的敏感性和特異性，發(fā)現(xiàn)各試劑盒間存在顯著差異。Sattler 等[10]用6 種ELISA 方法，在接種滅活PRRSV-1 型疫苗和隨后感染HP-PRRSV野毒株后，檢測(cè)豬血清中PRRSV 特異性抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)的ELISA 檢測(cè)中，PRRSV 感染后的S/P值均高于未接種組，只有一種ELISA 方法能夠在接種PRRSV 滅活疫苗的豬中檢測(cè)到可靠的PRRSV 抗體。因此，在進(jìn)行PRRSV 血清抗體檢測(cè)時(shí)，選擇合適的檢測(cè)試劑盒非常重要。

以上ELISA 檢測(cè)試劑盒均可檢測(cè)血清IgG 抗體，但在幼齡仔豬中，ELISA 檢測(cè)陽(yáng)性既可能是母源抗體也可能是感染抗體所致。為解決這個(gè)問(wèn)題，Rotolo 等[11]開(kāi)發(fā)了檢測(cè)唾液中的IgM-IgA PRRSV ELISA 檢測(cè)方法，并評(píng)估了在母源抗體存在下檢測(cè)豬源PRRSV 抗體的能力，結(jié)果確定IgM-IgA ELISA 能夠檢測(cè)出野生型PRRSV 感染產(chǎn)生的抗體。最近，Croft 等[12]對(duì)唾液中PRRSV 抗體檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，并在31 個(gè)商業(yè)豬場(chǎng)進(jìn)行了應(yīng)用，結(jié)果準(zhǔn)確率達(dá)到了98.5%。

1.2 分子生物學(xué)檢測(cè)

熒光定量PCR 敏感性和特異性高，逐漸成為PRRSV 精準(zhǔn)檢測(cè)的主要方法。目前已經(jīng)建立了基于Nsp2、ORF5和ORF7等基因的熒光定量PCR。但由于PRRS 毒株間的多樣性以及共感染等問(wèn)題，很多豬場(chǎng)均通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)，回收目的條帶，再送生物公司測(cè)序比對(duì)，來(lái)調(diào)查豬場(chǎng)的PRRS毒株類型，這種做法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。近些年，不同毒株的多重PCR 檢測(cè)在臨床診斷和檢測(cè)中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。在鑒別疫苗株和野毒株方面，張文利等[13]針對(duì)PPRSV 的Nsp2和ORF7基因區(qū)域，分別設(shè)計(jì)不同熒光標(biāo)記的MGB 探針及特異性引物，建立了一種能夠快速鑒別檢測(cè)PRRSV GDr180疫苗株與GD 野毒株的雙重?zé)晒舛縍T-PCR 方法，可用于PRRSV GDrl80疫苗株與野毒株的鑒別檢測(cè)。在鑒別不同類型毒株方面，Qiu 等[14]根據(jù)經(jīng)典毒株、高致病性毒株和類NADC30 毒株（C-PRRSV）等3 個(gè)不同PRRSV 的Nsp2靶基因序列，建立了可同時(shí)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)和區(qū)分上述3 種毒株的多重實(shí)時(shí)PCR。Yang 等[15]建立的PRRSV 多重RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)，能快速鑒別疫苗株JXA1-R、HP-PRRSV和C-PRRSV，其檢測(cè)靈敏度為24 拷貝/μL。

值得注意的是分子生物學(xué)檢測(cè)體現(xiàn)的是樣品中是否存在目標(biāo)核酸片段。有時(shí)雖然存在目標(biāo)核酸片段，但因引物、反應(yīng)體系或敏感度等問(wèn)題，導(dǎo)致檢測(cè)不出或出現(xiàn)假陰性結(jié)果；有時(shí)雖然樣品中不存在目標(biāo)核酸片段，但如果豬群中存在，那么采樣不合理（方法、數(shù)量、豬群選擇等）就會(huì)產(chǎn)生誤導(dǎo)。所以，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果必須與臨床和病理結(jié)合進(jìn)行綜合診斷。

2 疫苗研究進(jìn)展

2007 年，國(guó)際上制定了下一代PRRSV 疫苗新標(biāo)準(zhǔn)，包括快速誘導(dǎo)免疫，對(duì)PRRSV 流行毒株提供保護(hù)，對(duì)豬健康沒(méi)有不利影響以及可鑒別診斷免疫動(dòng)物與感染動(dòng)物等[16]。目前研制的PRRSV 疫苗包括活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、DNA 疫苗以及載體疫苗（表1），但依舊沒(méi)有符合上述所有標(biāo)準(zhǔn)的PRRSV 疫苗上市。

2.1 活疫苗

目前已經(jīng)由很多PRRSV-1 和PRRSV-2 的商品化活疫苗（MLV），比如勃林格、碩騰、海博萊等公司的產(chǎn)品[17]。Jeong 等[18]評(píng)價(jià)了PRRSV-2 活疫苗對(duì)韓國(guó)PRRSV-1 和PRRSV-2 異種單獨(dú)攻毒和聯(lián)合攻毒時(shí)的保護(hù)力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種疫苗后，均能產(chǎn)生較好的抗體，PRRSV 病毒血癥均有所下降；PRRSV 特異性IFN-γ 分泌細(xì)胞水平較高，且與攻毒對(duì)照相比，疫苗免疫后單一攻毒和聯(lián)合攻毒后的肺損傷和損傷肺的PRRSV 核酸均顯著減少。以上說(shuō)明豬接種PRRSV-2 疫苗對(duì)保護(hù)豬免受呼吸道疾病是有效的。Han 等[19]對(duì)比了活疫苗VR2332 MLV 和HuN4-F112 對(duì)PRRS 強(qiáng)毒株ZJnb16-2 的保護(hù)效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在攻毒前未檢測(cè)到抗ZJnb16-2的交叉中和抗體，而攻毒后則能檢測(cè)到，只是抗體效價(jià)較低。從臨床觀察的日增重等指標(biāo)以及其他指標(biāo)確定，上述兩種疫苗對(duì)強(qiáng)毒株ZJnb16-2 感染只有部分保護(hù)作用。在免疫時(shí)間上，一般認(rèn)為母源抗體對(duì)活疫苗存在一定的干擾，但最新的研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV-1 和PRRSV-2 活疫苗在1 日齡免疫后，也能產(chǎn)生較好的保護(hù)，且PRRSV-1 相比PRRSV-2 的疫苗保護(hù)力更好[20]。

表1 PRRSV 疫苗或正在開(kāi)發(fā)的疫苗清單

活疫苗在免疫效力上的缺點(diǎn)是某些疫苗的交叉保護(hù)效果不好。Jeong 等[21]發(fā)現(xiàn)PRRSV-1 活疫苗不能保護(hù)PRRSV-2 的攻擊。在國(guó)內(nèi)，針對(duì)普遍存在的類NADC30 毒株，目前的活疫苗保護(hù)力有限[22]，但也有報(bào)道稱，部分活疫苗對(duì)類NADC30毒株存在部分或完全保護(hù)[23-24]。最近，兩個(gè)誘導(dǎo)I型干擾素產(chǎn)生的PRRS 毒株已經(jīng)被測(cè)試作為候選疫苗[25]。其中PRRSV-A2MC2 是一株中等毒力毒株，與VR-2332 原始毒株的同源性為99.8%，具有很高的核苷酸同源性[26]。

2.2 滅活苗

與活疫苗相比，滅活疫苗具有更高的安全性。但由于其免疫效力差，市場(chǎng)占有率不高。2018年，浙江美保龍高效PRRSV 滅活疫苗上市。該滅活苗通過(guò)高抗原含量和腫瘤免疫技術(shù)，提高抗原“交叉遞呈”效率，確保免疫后能夠快速產(chǎn)生PRRSV 抗體，迅速誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，快速降低血液和組織中的PRRSV 載量[27]。Nan 等[25]表示PRRSV滅活苗可作為治療用，而不僅用于預(yù)防。雖然多數(shù)PRRSV 滅活疫苗的保護(hù)效率不高，但加上特異性佐劑，如山藥多糖和黃芪多糖[28-29]，就可以提高滅活苗的保護(hù)率。最新研究還表明，PRRSV 活疫苗和滅活苗一起使用，可以增強(qiáng)其免疫效果[30-31]。

2.3 亞單位疫苗和DNA 疫苗

除了改良活疫苗和滅活苗外，亞單位疫苗和核酸疫苗等也在研發(fā)中。Oh 等[32]用商品化PRRSV 亞單位疫苗，對(duì)晚期妊娠母豬異種PRRSV-1 和PRRSV-2 的保護(hù)效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，將母豬在產(chǎn)前56、35 d（妊娠58、79 d）分別肌內(nèi)接種，在產(chǎn)前21 d（妊娠93 d）用PRRSV-1 或PRRSV-2進(jìn)行鼻內(nèi)攻毒。結(jié)果顯示：接種疫苗的母豬在妊娠114～115 d 之間產(chǎn)仔，但所有未接種疫苗的母豬在妊娠105～110 d 流產(chǎn)；與未接種的母豬相比，接種的母豬PRRSV 病毒血癥水平顯著降低（P＜0.05），病毒中和抗體和干擾素γ 分泌細(xì)胞水平顯著升高（P＜0.05）。這一結(jié)果表明，PRRSV 亞單位疫苗用于妊娠晚期的預(yù)防是有效的。在DNA疫苗方面，Cui 等[33]的研究發(fā)現(xiàn)，GP5 嵌合DNA疫苗對(duì)VR2332 和MN184C-PRRSV 株均產(chǎn)生細(xì)胞反應(yīng)性和較高水平的中和抗體，但重組GP5-WT 疫苗只對(duì)VR2332 產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，說(shuō)明GP5 嵌合DNA 疫苗對(duì)異種PRRSV 具有保護(hù)作用。

2.4 聯(lián)苗

目前，越來(lái)越多的豬病種類促進(jìn)了PRRSV 與其他病原的聯(lián)苗研究。Oh 等[34]在研究PRRSV、圓環(huán)病毒2 型（PCV2）和豬肺炎支原體（Mhp）三價(jià)疫苗的免疫效力時(shí)，發(fā)現(xiàn)三價(jià)疫苗能有效抵抗Mhp、PCV2 和PRRSV 的三重攻擊，但與單苗相比，免疫保護(hù)率有所差別。在國(guó)內(nèi)，華威特和碩騰等公司已經(jīng)有了商品化的PRRSV 和CSFV 二聯(lián)苗，可以同時(shí)防控PRRS 以及CSF。

3 結(jié)語(yǔ)

我國(guó)PRRS 毒株呈多亞群共存，不同亞群毒株毒力及中和保護(hù)位點(diǎn)存在差異，同一亞群毒株毒力及保護(hù)位點(diǎn)也有差異等特點(diǎn)，為該病防疫帶來(lái)了較大壓力。因此，通過(guò)科學(xué)檢測(cè)以及將嚴(yán)格的生物安全和合理設(shè)計(jì)的疫苗接種方案結(jié)合起來(lái)，進(jìn)行田間毒株檢測(cè)和基因分析，然后選擇相應(yīng)基因型毒株疫苗進(jìn)行免疫，對(duì)控制農(nóng)場(chǎng)以及地區(qū)的PRRS 具有非常重要的作用。