饒清，何文姬，龍淑英，蔣鴻超，孫強明，張楨

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 昆明市兒童醫(yī)院檢驗科，昆明 650228； 2.云南省兒童重大疾病研究重點實驗室昆明市兒童醫(yī)院兒科研究所，昆明 650100； 3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，昆明 650118)

黃病毒包括許多重要的人類病原體，它們通過蚊子(黃熱病毒、登革病毒、寨卡病毒、西尼羅病毒和日本乙型腦炎病毒)或蜱蟲(森林腦炎病毒)傳播給脊椎動物宿主。寨卡病毒、西尼羅病毒和登革病毒的暴發(fā)和流行區(qū)域的急劇擴張在歷史中均有記載，這突出了黃病毒作為新興病原體的影響[1-2]。日本腦炎(Japanese encephalitis，JE)是由日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的媒介傳播的人畜共患病，通過庫蚊叮咬傳播，主要為三帶喙庫蚊。由于預(yù)計庫蚊和伊蚊的地理區(qū)域?qū)黾?，會出現(xiàn)新的JEV疫區(qū)，特別是考慮到亞熱帶和溫帶地區(qū)濕度增加，平均氣溫升高使其成為潛在的疫區(qū)[3-6]。JE的臨床表現(xiàn)通常以非特異性發(fā)熱性疾病開始，包括頭痛、散發(fā)性鼻炎和胃腸道癥狀，隨后進展為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，包括嚴(yán)重抽搐、腦膜炎/腦膜腦炎，或脊髓灰質(zhì)炎樣疾病[7]。JEV引起的腦炎是東亞、東南亞和南亞地區(qū)病毒性腦炎的主要形式[8]。世界上近60%的人口，超過30億人生活在JEV流行地區(qū)[9]。JEV的主要易感人群是15歲以下兒童，病毒潛伏期為5～15 d。每年報告的JE病例超過6.8萬例，其中20%～30%的病例是致命的，死亡率為14%～21%，且多達50%的幸存者可能出現(xiàn)長期的神經(jīng)后遺癥[10-11]。JE患者傳統(tǒng)的診斷方法為世界衛(wèi)生組織推薦的IgM抗體捕獲酶聯(lián)免疫吸附法檢測患者血液或腦脊液樣本中的抗乙腦IgM抗體。然而，目前該診斷方法存在公認(rèn)的局限性[12-13]。本研究旨在構(gòu)建JEV GⅢ型拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒以助于JE的早期防控，并為JEV GⅢ型后期的研究提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1菌株、載體 BHK-21細(xì)胞、JEV GⅢ型由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供；pMD19-T載體購于日本TaKaRa公司；大腸埃希菌DH5α購自昆明碩擎生物科技有限公司。

1.2主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒購自德國QIAGEN公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、loading buffer、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)MIX購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自北京TIANGEN公司，熒光定量試劑購自北京TSINGKE公司；CFX96 Real-Time PCR儀購自美國Thermo Fisher公司，超微量分光光度計購自德國IMPLEN公司。

1.3JEV在適應(yīng)株上的培養(yǎng) 準(zhǔn)備兩瓶T25 BHK-21細(xì)胞(分別為對照組和實驗組)，狀態(tài)良好，致密單層，棄上清，用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞3次。對照組細(xì)胞于37 ℃加入2.2 mL 5%的最小必需培養(yǎng)基(minimal essential medium，MEM)，5% CO2的培養(yǎng)箱吸附2 h，每20分鐘晃動細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使病毒均勻吸附。2 h后補加8 mL 5%的MEM病毒維持液,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～5 d，倒置顯微鏡下觀察實驗組細(xì)胞病變程度(++++)，將細(xì)胞放入-80 ℃冰箱凍存。次日，將細(xì)胞反復(fù)凍融3次后經(jīng)0.22 μm過濾器收集病毒液，分裝后-80 ℃凍存，即為獲得的病毒液。實驗組細(xì)胞加入200 μL JEV和2 mL 5%的MEM(5%的MEM：MEM+5%胎牛血清+1%雙抗+2%谷氨酰胺+2% NaHCO3)。

1.4標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建 NCBI數(shù)據(jù)庫下載JEV標(biāo)準(zhǔn)序列(GenBank:MH258853)，設(shè)計特異性引物擴增乙腦病毒PrM蛋白區(qū)部分基因序列。上游引物Forward：5′CCAGGGGAAGCTTTTGAT 3′，下游引物Reverse：5′ACGCGTTGACCGTTGTTA 3′。按照試劑盒操作流程提取病毒液中的基因組RNA，得到的乙腦病毒基因組RNA通過反轉(zhuǎn)錄-PCR擴增乙腦病毒PrM蛋白區(qū)域，擴增條件為98 ℃ 2 min預(yù)變性；98 ℃ 10 s，52.6 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠確認(rèn)擴增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，隨后將回收產(chǎn)物連接到pMD-19T克隆載體上。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含100 μg/mL氨芐西林抗性的LB(Luria-Bertani)固態(tài)平板，培養(yǎng)箱37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單個菌進行單克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行雙酶切(Sal1、Bamh1)，測序(昆明擎科生物有限公司)鑒定結(jié)果為JEV GⅢ PrM蛋白區(qū)目的基因序列；將序列鑒定正確的陽性菌株進行培養(yǎng)，獲得JEV標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，并用超微量分光光度計測定乙腦病毒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度。標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的拷貝數(shù)計算公式：(Amount×10-9×6.022×1023)/(Length×660)= Number of copies(copies/μL)。其中，Amount為超微量分光光度計測得標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度(ng/μL)，Length代表模板DNA長度，帶入公式中得到乙腦病毒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)?？截悢?shù)。

1.5標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒體系的建立 根據(jù)JEV PrM蛋白區(qū)目的基因序列設(shè)計實時熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)特異性引物：上游 Forward primer：5′TCAACGAAAGCCACACGA 3′；下游Reverse primer：5′GTACCGCCGCCAGGAAAG 3′。將JEV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒用無核酸酶的水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9梯度稀釋至10-9，按推薦反應(yīng)體系以SYBR法實時熒光定量PCR (預(yù)變性：95 ℃ 60 s；95 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s進行40個循環(huán)；72 ℃ 延伸15 s)檢測標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒擴增效率和特異性。根據(jù)RT-qPCR獲得標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的擴增曲線與熔解曲線。同時以得到的Ct值作為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)?？截悢?shù)Log10作為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得到JEV標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.6JE患者血清中病毒拷貝數(shù)定量檢測 取JE患者血清1份(西雙版納人民醫(yī)院提供)150 μL按RNA病毒提取試劑盒(購自德國QIAGEN公司)提供的操作方法獲得40 μL基因組RNA，隨后取6 μL RNA逆轉(zhuǎn)錄得到20 μL互補DNA。取2 μL互補DNA，連續(xù)用無核酸酶的水按10倍梯度稀釋至10-1～10-4，每個梯度設(shè)置3個復(fù)孔。利用標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每管病毒拷貝數(shù)，病毒拷貝數(shù)=(每管病毒拷貝數(shù)×20×40)/(150×6)。

2 結(jié) 果

2.1JEV prM區(qū)域片段的獲得 特異性引物擴增得到的目的片段產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳后，經(jīng)核酸成像儀可見目的條帶單一且大小為441 bp條帶(圖1),測序結(jié)果經(jīng)BioEdit軟件比對表明序列正確。

JEV：日本乙型腦炎病毒；PCR：聚合酶鏈反應(yīng)；1：目的條帶；DNA Marker：DL2000 DNA Marker (DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量)

2.2JEV標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定 構(gòu)建好的JEV標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒利用Sal1酶和Bamh1酶進行雙酶切于37 ℃培養(yǎng)箱過夜。酶切產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠后，經(jīng)核酸成像儀可見兩個目的條帶，大小約477 bp和2 656 bp(圖2)，對條帶進行回收測序表明結(jié)果無誤。

JEV：日本乙型腦炎病毒；1：標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的酶切條帶；Marker：DL2000 DNA Marker(DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量)

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及JE患者血清中拷貝數(shù)的測定 通過RT-qPCR得到標(biāo)準(zhǔn)品Ct值，乙腦病毒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒Amount為153 ng/μL，DNA Length為3 049，從而得到JEV標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒10倍梯度倍比稀釋對應(yīng)的病毒拷貝數(shù)(由于10-1標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度高達到了儀器默認(rèn)的閾值，未檢測到Ct值)。標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度Ct平均值、反應(yīng)體系中的標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的Log10，見表1。最后以標(biāo)準(zhǔn)品Ct值作為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)Log10作為Y軸繪制JEV標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，得到標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=-0.288 9x+11.516，R2=0.993。

表1 JEV標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒對應(yīng)稀釋度的Ct值、拷貝數(shù)及拷貝數(shù)的Log10

JEV：日本乙型腦炎病毒

2.4JE患者血清原液及倍比稀釋的樣品拷貝數(shù) 根據(jù)RT-qPCR獲得標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的擴增曲線與熔解曲線，見圖4。同時以得到的Ct值作為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒拷貝數(shù)Log10作為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到JEV標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-0.288 9x+11.516。利用得到的JEV標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程推算出JE患者血清原液及倍比稀釋的樣品拷貝數(shù)分別為1 184 130.27、120 912.86、10 736.84、1 053.45、121.25 copies/μL，見表2。

表2 JEV血清原液及梯度稀釋樣品檢測結(jié)果

3 討 論

1964年，從日本首次報道的流行病例中分離出JEV[14]。根據(jù)病毒包膜基因，將JEV分為5種基因型：JEV(GⅠ)、JEV(GⅡ)、JEV(GⅢ)、JEV(GⅣ)和JEV(GⅤ)[15]。研究表明，JE的發(fā)病常見于南亞和東亞，包括中國、尼泊爾和印度[16]。

在JEV導(dǎo)致的腦炎患者中，50%的病例會導(dǎo)致永久性的神經(jīng)精神后遺癥，如癱瘓和智力殘疾[17]。JEV的發(fā)病率和死亡率較高，但目前仍沒有預(yù)防神經(jīng)癥狀發(fā)展的治療方法[18-19]。對于JEV最有效的方法為疫苗接種。疫苗的使用極大地降低了乙型腦炎的發(fā)病率，然而對成本、供應(yīng)、不良反應(yīng)和有效性的考慮使中低收入國家難以實現(xiàn)疾病控制[16]。目前，亞太地區(qū)有30多億人面臨JEV的傳播風(fēng)險[20]。該病的全球負(fù)擔(dān)和相關(guān)死亡率仍較高，因此有必要實現(xiàn)更高的疫苗接種覆蓋率。據(jù)報道，日本目前使用的JEV疫苗在Muar株(JEV GⅤ原型株)上引起的中和抗體滴度水平低于在JEV GⅠ和GⅡ上[21]。未來，JEV疫苗的研發(fā)應(yīng)對GⅠ～GⅤ型同樣適用。

以往JEV的診斷均是通過檢測患者血液或腦脊液樣本中的抗乙腦IgM抗體，但該方法存在一定的局限性。本研究構(gòu)建的JEV GⅢ質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在10倍梯度稀釋下Ct值穩(wěn)定，同時對患者梯度血清稀釋樣品(10-1～10-4)的檢測結(jié)果顯示Ct值穩(wěn)定(每個梯度設(shè)置3個復(fù)孔，且數(shù)值相差在0.5以內(nèi))，熔解曲線特異性好，表明該標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒對病毒的早期檢測靈敏、高效、穩(wěn)定，可為實驗室研究JEV提供便捷手段。目前，大多數(shù)日本乙型腦炎患者的治療目的是降低死亡率或改善治療效果，仍沒有藥物可以完全阻止JEV進入細(xì)胞或其在人體的復(fù)制，或治愈JEV感染[22]。

JEV：日本乙型腦炎病毒

此外，臨床缺乏針對日本乙型腦炎患者的特效藥物，而本研究構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)?？蔀槲磥砜笿EV藥物的篩選及相關(guān)機制的研究提供策略。

然而，本研究也存在不足。雖然在亞洲JE患者主要由GⅢ型引起，但其他血清型病毒患者仍然存在。JEV各基因型的分布與地理區(qū)域有關(guān)。中國分離的JEV主要為 GⅠ、GⅢ、GⅤ基因型[23]。GⅠ基因型能進一步分為兩個亞型：GⅠ-a和GⅠ-b，其中GⅠ-a的分布局限于泰國和柬埔寨，而GⅠ-b是目前JEV分離株中最常見的基因型[24]。1935—1980年，GⅢ是JEV流行區(qū)域的主要基因型，此后逐漸被GⅠ-b取代[24-26]，這一趨勢在亞洲其他許多地區(qū)已觀察到，并反映了其復(fù)制效率高[27]，還表現(xiàn)出對極端溫度的耐受性[28]。目前，JEV GⅢ型仍是優(yōu)勢基因型。本研究構(gòu)建的JEV GⅢ型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品適用于大多數(shù)患者，但對于JEV其他血清型患者是否適用仍不清楚，后期有必要針對其他血清型JEV進行檢測。

綜上所述，本研究構(gòu)建好的JEV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品不僅可提高JEV的檢測效率，還能對病毒研究過程中的病毒載量進行動態(tài)監(jiān)測。