呼寧寧,安瑞華

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，哈爾濱 150001)

膀胱癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，病死率較高，發(fā)病率逐年上升，根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)的報告顯示，2018年全世界新發(fā)膀胱癌549 393例，死亡199 922例[1]，新發(fā)病例中70%～80%被診斷為非肌肉浸潤性膀胱癌[2-4]。盡管膀胱癌的治療經(jīng)歷了外科手術聯(lián)合術后膀胱灌注化療，但仍有高達50%的非肌肉浸潤性膀胱癌患者復發(fā)，而20%的患者在5年內(nèi)病情繼續(xù)進展[5]。因此，迫切需要開發(fā)新的療法。自噬是一種基本的分解代謝過程，可以通過各種細胞應激來激活該過程，包括營養(yǎng)剝奪、細胞器損傷、放化療等[6]。在癌癥發(fā)展的初始階段，自噬通過維持基因組完整性并防止癌細胞增殖，在抑制腫瘤方面發(fā)揮重要作用[7]。但在癌癥確定后，癌細胞可能會利用自噬在不利的微環(huán)境中抵抗細胞應激[8]。此外，自噬被認為是治療癌癥的“雙刃劍”。抗癌治療誘導的細胞保護性自噬在癌細胞的耐藥過程中起重要作用。因此，自噬抑制可以增加癌細胞對抗癌治療的敏感性。相反，自噬促進可能誘導Ⅱ型程序性細胞死亡，稱為自噬細胞死亡[9]?，F(xiàn)就自噬調(diào)節(jié)在膀胱癌發(fā)展和治療中的研究進展進行綜述。

1 自噬調(diào)節(jié)與膀胱癌

目前，已有30多種自噬相關基因和同源蛋白被確定為自噬所必需的[10]。因此，響應各種壓力的自噬激活會導致自噬相關蛋白[包括微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)、Beclin1等]表達水平發(fā)生變化。LC3是自噬體形成的特定蛋白質(zhì)標記。在類自噬相關基因(autophagy-related gene，ATG)8泛素結(jié)合系統(tǒng)中，LC3首先被ATG4(一種特定的半胱氨酸蛋白酶)裂解，從而暴露出C端半胱氨酸。隨后，LC3通過ATG7、ATG3與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)，從而促進細胞質(zhì)LC3-Ⅰ向膜結(jié)合型LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化[11]。Ojha等[12]比較非肌肉浸潤膀胱癌患者的組織樣本與正常膀胱尿路上皮組織樣本發(fā)現(xiàn)，在高級別和低級別尿路上皮癌標本中,作為自噬誘導標志物的LC3均顯著升高,且在高級別尿路上皮癌標本中升高更顯著。與正常的尿路上皮細胞相比,饑餓誘導的自噬在高級別和低級別尿路上皮癌中均更容易發(fā)生。當膀胱癌組織暴露于自噬抑制劑,如磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide-3-kinase,PI3K)抑制劑、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)或氯喹時,在類似的饑餓條件下,高級別膀胱癌的細胞死亡率明顯高于低級別膀胱癌，表明在外部有害因素作用下,自噬對膀胱癌細胞起保護作用,且在高級別膀胱癌細胞中作用更加明顯。Beclin1是一種多域蛋白，可調(diào)節(jié)自噬和凋亡之間的相互干擾。Ⅲ類PI3K復合體已被確認為調(diào)節(jié)自噬通量并平衡自噬和凋亡過程的重要信號樞紐。一方面,Beclin1依賴于Beclin1-PI3K催化亞基3型復合體促進吞噬泡的聚集與組裝而參與自噬體的形成,另一方面,Beclin1與其他相關蛋白共同作用而調(diào)節(jié)自噬體的成熟。因此，Beclin1作為Ⅲ類PI3K調(diào)節(jié)亞基，在通過磷酸化和泛素化作用調(diào)節(jié)自噬中起重要作用[13]。王振龍等[14]采用分支DNA-液相芯片法檢測53例膀胱癌組織標本和20例癌旁組織標本中 Beclin1的表達水平，結(jié)果顯示，膀胱癌組織中Beclin1 mRNA的高表達率低于癌旁正常組織。提示在膀胱癌發(fā)生早期，細胞自噬可能被抑制，Beclin1 mRNA的高表達率與膀胱癌病理分級、生長方式、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等預后因素有關，腫瘤分化程度越低，Beclin1 mRNA高表達率越低。在惡性程度更高的膀胱癌(T2～4期)中，Beclin1 mRNA高表達率更低。李飛[15]采用免疫組織化學法研究Beclin1蛋白在膀胱癌組織中的表達，表明在膀胱癌發(fā)展惡化過程中Beclin1基因表達起重要作用。可見,自噬調(diào)節(jié)與膀胱癌密切相關。因此,利用細胞自噬研發(fā)新型藥物將極大地促進膀胱癌預防與治療策略的改進與發(fā)展。

2 自噬調(diào)節(jié)在膀胱癌治療中的作用

在腫瘤形成過程中，自噬通過維持基因組完整性并防止癌細胞增殖而在抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起主要作用[7]。Zhu等[16]研究證明,ATG7在侵襲性膀胱癌中明顯過表達，這種蛋白的敲低能夠顯著抑制膀胱癌的侵襲，提示ATG7可能參與膀胱癌的發(fā)育調(diào)控。自噬在癌癥治療中具有雙重作用：一方面，抑制自噬可以增加化療和放療等治療的細胞毒性作用[17-19]；另一方面，自噬的過度激活可能導致自噬細胞死亡，也稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，與細胞凋亡相似，被定義為在溶酶體存在下的細胞死亡[19-24]。因此，為了開發(fā)新的治療藥物，確定自噬在癌細胞中的作用至關重要。

2.1抑制膀胱癌的保護性自噬 外科手術結(jié)合膀胱灌注化療藥物是降低膀胱癌患者腫瘤復發(fā)率的常規(guī)治療。然而，盡管進行了有效的治療，大多數(shù)患者仍然經(jīng)歷疾病復發(fā)并最終因腫瘤轉(zhuǎn)移而死亡[25]。預后不良通常歸因于對各種治療干預措施的抵抗力。研究表明，癌細胞可以通過多種機制實現(xiàn)抗藥性，包括細胞內(nèi)在和外在因素，如遺傳異質(zhì)性[26]、自噬[27]、腫瘤微環(huán)境[27]和癌癥干細胞因子[28]。此外，自噬可以通過提供細胞能量需求并在低氧、氧化應激、炎癥和細胞因子釋放等應激條件下防止細胞毒性來影響腫瘤的微環(huán)境。此外，自噬可能通過促進干細胞的維持而影響腫瘤干細胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)[29]。大量研究表明，通過多種途徑抑制保護性自噬的方法包括藥物抑制劑[17，19，30-31]、RNA干擾劑[30，32]和天然生物活性化合物[33-34](表1)，能夠提高膀胱癌對治療干預措施的敏感性。

2.1.1自噬抑制劑氯喹 氯喹是一種抗瘧疾藥物，是抑制自噬的最常用和最有效的藥物。目前氯喹及其衍生物羥氯喹是美國食品藥品管理局批準的唯一臨床可用的自噬抑制劑[35]。氯喹及其衍生物羥氯喹是弱親脂性堿基，具有在溶酶體中積累的能力，從而增加了溶酶體的pH值。隨后，溶酶體的堿化作用阻止其與自噬體融合，并使溶酶體酸性蛋白酶失活，從而防止自身溶酶體中的貨物降解。研究表明，氯喹介導的溶酶體功能障礙可使癌細胞對化療和放療敏感，從而增強這種治療方法的抗癌作用。一項氯喹聯(lián)合順鉑處理膀胱癌細胞的研究表明，自噬的抑制作用增強了順鉑的細胞毒性[19]。另一項研究揭示了相同的結(jié)果，即使用氯喹抑制順鉑誘導的自噬可顯著增加膀胱癌細胞對順鉑的敏感性，從而增強其細胞毒性[30]。上述研究表明，順鉑可誘導自噬作為膀胱癌細胞的一種保護機制，而抑制自噬可顯著增強順鉑耐藥細胞的化學敏感性。

2.1.2自噬抑制劑3-MA 3-MA是Ⅲ類PI3K抑制劑。PI3K是脂質(zhì)激酶的多樣化家族，在細胞過程中起重要作用，包括細胞增殖、代謝和自噬調(diào)節(jié)[36-37]。Ⅲ類PI3K是哺乳動物細胞中三類PI3K之一，是自噬的激活劑，在自噬體形成早期階段起重要作用。Fan等[31]進行了一項研究，旨在評估防己堿(一種在Stephania tetrandra中發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物)對膀胱癌的抗腫瘤作用，結(jié)果顯示，防己堿能夠誘導膀胱癌細胞自噬和凋亡，3-MA抑制自噬可導致防己堿誘導的凋亡增強，胱天蛋白酶(caspase)-3的分裂增加是明顯的證據(jù)[31]。上述研究表明，保護性自噬的抑制可以增強抗癌藥物的凋亡率。

2.1.3針對RNA干擾 近年來已經(jīng)進行了越來越多的針對RNA干擾的研究，以進一步探索保護性自噬抑制作用對抗癌治療的影響。Kang等[32]證明通過禁用ATG12(自噬體形成和完成的關鍵轉(zhuǎn)錄基因之一)對自噬的遺傳抑制能夠增強表皮生長因子受體抑制劑對膀胱癌細胞的抗癌作用。將siRNA轉(zhuǎn)染到膀胱癌細胞中通過阻斷ATG12抑制自噬。隨后，將轉(zhuǎn)染的細胞用表皮生長因子受體抑制劑拉帕替尼或吉非替尼處理，流式細胞術分析證實，與表皮生長因子受體抑制劑聯(lián)合使用時，ATG12-siRNA抑制自噬協(xié)同增加凋亡細胞死亡，表明自噬是膀胱癌細胞的一種保護機制[32]。此外，Lin等[30]將自噬抑制劑短發(fā)夾RNA為基礎的慢病毒與順鉑結(jié)合，證明利用短發(fā)夾RNA通過敲除ATG7/ATG12或Beclin1來抑制自噬，能夠協(xié)同增強順鉑對膀胱癌5637和T24細胞的抗癌能力。結(jié)果表明，短發(fā)夾RNA抑制自噬可增加順鉑誘導的凋亡，這可通過caspase-3裂解的增強來證明，表明順鉑與自噬抑制劑的組合能夠增加膀胱癌細胞對順鉑的敏感性，從而增強這種化療藥物的細胞毒性[30]。總之，自噬已被確定為導致癌癥治療耐藥性的關鍵機制。此外，自噬被認為是與常規(guī)療法結(jié)合的涉及自噬抑制劑療法的潛在靶標。保護性自噬的抑制可能增加膀胱癌對化療或放療的敏感性，為癌癥治療過程中自噬的有效調(diào)節(jié)提供重要信息。

2.2膀胱癌自噬細胞死亡的激活 自噬在癌癥治療中起雙重作用，除細胞保護性自噬外，細胞毒性自噬是細胞自噬的另一種主要形式，可單獨或與凋亡相關聯(lián)地促進細胞死亡。從功能上分析，細胞毒性自噬能夠減少活細胞的數(shù)量和(或)降低治療后的克隆形成存活率[38]。Gewirtz[38]推測自噬在癌癥治療中的雙重作用可能與自噬機制的特定信號通路和(或)底物有關。此外，高自噬水平可能會誘發(fā)Ⅱ型程序性細胞死亡，這也稱為自噬細胞死亡[20]?；谶@一概念進行了多項研究，以探討自噬細胞死亡在不同癌癥治療領域的治療潛力。在膀胱癌中，帕唑帕尼的化學療法[21]、氟利昂堿氟化物的生物療法[22]和替代療法[23-24,39]均發(fā)現(xiàn)自噬細胞死亡(表2)。

2.2.1血管內(nèi)皮生長因子 在抗血管生成劑中，我國自主研發(fā)的靶向抑制血管內(nèi)皮生長因子受體2的抑制劑阿帕替尼可競爭性結(jié)合該受體胞內(nèi)酪氨酸ATP結(jié)合位點，高度選擇地抑制血管內(nèi)皮生長因子受體2酪氨酸激酶活性，阻斷血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導，抑制腫瘤血管生成[40]。靶向血管內(nèi)皮生長因子受體的口服酪氨酸激酶抑制劑帕唑帕尼已被批準用于轉(zhuǎn)移性腎細胞癌和軟組織肉瘤的治療[21]。但帕唑帕尼用于膀胱癌的開發(fā)仍處于臨床研究的初始階段。先前的研究(其中用帕唑帕尼處理膀胱癌細胞)表明，這種抗血管生成劑能夠通過增加胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2磷酸化來誘導自噬，如LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例增加，酸性泡狀細胞器的形成，p62蛋白降解和自噬通量[21]，表明帕唑帕尼誘導的自噬細胞死亡與組織蛋白酶B活性增加有關。在分子水平上對膀胱癌細胞的基因表達進行比較分析表明，帕唑帕尼通過影響自噬基因的表達(如ATG9B的上調(diào)和腫瘤蛋白p73基因的下調(diào))誘導細胞毒性自噬[21]。

表2 自噬細胞死亡的激活劑

2.2.2紅景天苷 紅景天苷是從玫瑰紅景天中分離出來的一種生物活性酪氨酸衍生的酚類化合物，具有抗疲勞、缺氧、心血管疾病和癌癥的特性[41]。此外，紅景天苷已被證明能誘導自噬細胞死亡以及膀胱癌細胞凋亡[23]。研究證實紅景天苷通過自噬/PI3K/蛋白激酶B和基質(zhì)金屬蛋白酶9信號通路引起細胞凋亡[23]。Kou等[24]指出，粉防己堿誘導的自噬可能通過調(diào)節(jié)AMP活化蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路協(xié)同增強人膀胱癌細胞的凋亡。

2.2.3氨基肽酶N 氨基肽酶N被稱為細胞表面分子CD13，參與多種細胞生命活動，包括細胞存活、血壓調(diào)節(jié)、血管生成、腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[42]。有研究顯示，氨基肽酶N通過下調(diào)氨基肽酶N表達抑制蛋白激酶B信號轉(zhuǎn)導途徑誘導自噬，從而抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲[39]。相反，3-MA的自噬抑制逆轉(zhuǎn)了烏苯美司的抗增殖特性，表明烏苯美司能夠誘導膀胱癌細胞自噬細胞死亡[39]。

3 結(jié) 語

盡管在過去的幾十年進行了大量的研究來證實膀胱癌的新治療方法，但是膀胱癌患者的治療和長期存活率仍然相對停滯，臨床結(jié)果沒有顯著改善。自噬已被證明是一個復雜的細胞過程，在治療膀胱癌中具有不同的作用。自噬激活劑和抑制劑的應用為開發(fā)針對人膀胱癌新型治療的選擇提供了進一步認識。自噬抑制劑(包括氯喹和3-MA)可能更有利于膀胱癌治療，因為它們能增加癌細胞對化療或放療的敏感性。因此，更好地了解自噬在膀胱癌發(fā)生發(fā)展各個階段的機制及其在膀胱癌治療中的作用對于選擇靶向自噬途徑的有效藥物至關重要。