李璐，譚舜，王彪，徐建榮，韓曉磊

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

線粒體DNA 是共價閉合的雙鏈DNA 分子，核酸組成和序列較保守，基因排列的順序穩(wěn)定而緊密，無單拷貝和重組，含有豐富的進化信息，具有長度短、含量豐富、母性遺傳和進化速度快等特點，已成為研究動物遺傳分化及起源進化的理想手段[1-5]。通常，線粒體D-loop 區(qū)是線粒體基因組中進化速度最快、多態(tài)性最為豐富的部分，該區(qū)的變異廣泛用于魚類親緣關(guān)系、種屬分類、遺傳分化和遺傳多樣性等研究[6-8]。

中華鱉Trionyx sinensis（俗稱甲魚、團魚、王八等），分布廣泛，除西藏和青海以外的其它各省均有發(fā)現(xiàn)，長江流域和華南地區(qū)分布較多[9,10]。江蘇省境內(nèi)有兩大淡水湖泊，即長江水系的太湖（中國第三大淡水湖）和淮河水系的洪澤湖（中國第四大淡水湖）中華鱉是傳統(tǒng)特色漁業(yè)資源。近年來，受自然環(huán)境和人為因素的影響，導致中華鱉兩個相對獨立的地理群體，即太湖鱉群體和洪澤湖鱉群體的自然資源均急劇減少，種質(zhì)資源也受到了嚴重威脅。主要分布于長江中下游的太湖花鱉是中華鱉的地方特色品種，與普通中華鱉體色差異較大，即背上有對稱的黑色小圓花點，野生環(huán)境中身體油綠，腹部有明顯灰黑色塊狀花斑；太湖花鱉群體面臨外界環(huán)境的壓力，種群資源日益減少。目前，中華鱉種質(zhì)資源，特別是其亞種分類還沒有明確的論斷，不同的地理群體的區(qū)分也不甚明了，其中太湖花鱉的研究更是鮮有報道[11]。本文利用線粒體D-loop 區(qū)序列比對技術(shù)分析了中華鱉不同群體的遺傳多樣性，判斷其群體間是否有遺傳分化，為中華鱉不同群體間的種質(zhì)鑒定和分類提供一定的理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

2018 年5—11 月期間，在太湖流域蘇州太倉、常州武進和洪澤湖流域宿遷泗洪地區(qū)分別采集了太湖花鱉（簡稱H，野生群體，圖1）30 尾、太湖鱉（簡稱T，野生群體，圖1）19 尾和洪澤湖鱉（簡稱Z，野生群體，圖1）20 尾。將這三個群體中華鱉腿部肌肉樣品置于無水乙醇中，-20℃保存，用于D-loop區(qū)序列分析。

1.2 方法

DNA 提?。褐腥A鱉基因組DNA 的提取參照韓曉磊等[12]的方法。用分光光度計（Thermo Scientific NanoDrop 2000）測定基因組DNA 的濃度；用凝膠成相系統(tǒng)（UVP Biospectrum 410）檢測DNA 的完整性，檢測合格的DNA 置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR 擴增、測序及分析：根據(jù)GenBank 上中華鱉線粒體基因組序列（AY687385.1）設(shè)計用于擴增D-loop 區(qū)的2 對引物（表1），送蘇州金唯智生物科技有限公司進行合成，用去離子雙蒸水將其溶解至濃度為20 μmol/L。PCR 擴增反應(yīng)體積為25 μL，含模板基因組DNA 100 ng、10×Buffer 2.5 μL、2.5mol/L MgCl22.0 μL、dNTP 1.5 μL、上下游引物各1 μL、1 U Taq DNA 聚合酶，加無菌水補足。PCR 反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性45 s，55.3 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收純化后送至蘇州金唯智生物科技有限公司直接進行序列測定。為保證序列的準確性，序列經(jīng)過正反兩次重復測定。所獲得的序列經(jīng)校對后，采用DNAMAN 7.0 軟件進行序列比對；利用DNAsp 4.0 軟件統(tǒng)計單倍型及變異位點、計算單倍型多樣性（Hd）及核苷酸多樣性（π），評價群體遺傳多樣性水平；用MEGA 5.1 軟件計算群間和群內(nèi)的遺傳距離，分析堿基組成及核苷酸位點的替換數(shù)。

表1 中華鱉線粒體D-loop 區(qū)擴增引物及序列Tab.1 Primer of amplification and the sequence in wild Chinese soft-shelled turtle（T.sinensis）

2 結(jié)果與分析

2.1 中華鱉線粒體D-loop 區(qū)序列分析

將獲得的序列與GenBank 中序列號為AY687385.1 的中華鱉線粒體DNA 序列進行同源比對，證實測得的序列位于中華鱉線粒體D-loop 區(qū)范圍之內(nèi)，片段長度為513～518 bp，與設(shè)計產(chǎn)物515 bp 大小相符。于GenBank 上進行Blast 比對，分析結(jié)果與中華鱉已提交線粒體DNA 序列（NC_006132.1和AY962573.1）相應(yīng)基因片段的同源性達95%以上，說明測得序列的準確性。

經(jīng)軟件分析，獲得的測序片段之間同源性為95.76%，存在個別位點的核苷酸的變異共計12 個，總變異率為2.43%，平均轉(zhuǎn)顛換比（Ts/Tv）為2.3。中華鱉三個群體D-loop 區(qū)的堿基組成分析顯示：A、T、C 和G 堿基平均含量分別為26.9%、33.9%、30.3%和8.9%，其中A+T 含量（60.8%）明顯高于G+C 含量（39.2%），表現(xiàn)出明顯的反G 偏倚。

2.2 中華鱉群體遺傳多樣性分析

利用DNAsp 軟件計算了中華鱉69 個個體線粒體D-loop 序列的遺傳多樣性指數(shù)，三個群體的單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（π）數(shù)值均是洪澤湖鱉群體＞太湖花鱉群體＞太湖鱉群體（表2）；三個群體間單倍型多樣度（Hd）為0.381，核苷酸多樣性（π）為0.0043。

表2 中華鱉群體遺傳多樣性指數(shù)分析Tab.2 Genetic diversity indices of three different populations of wild Chinese soft-shelled turtle（T.sinensis）

2.3 中華鱉群體差異分析

DNAMAN 軟件的序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，太湖花鱉群體、太湖鱉群體和洪澤湖鱉群體群內(nèi)序列同源性分為99.23%、99.14%和98.95%；三個群體間序列同源性為95.76%。通過MGEA 軟件分析三個群體的遺傳距離發(fā)現(xiàn)，太湖花鱉群體與洪澤湖鱉群體遺傳距離較大，太湖鱉群體與洪澤湖鱉群體遺傳距離較小，三個群體間遺傳距離為0.0479（表3）。MEGA 軟件建立的NJ 分子系統(tǒng)樹呈現(xiàn)出清晰的兩大群體，太湖花鱉群體單獨聚類；太湖鱉群體和洪澤湖鱉群體形成聚類，但在類群內(nèi)可見兩個群體有一定的分化趨異（圖2）。

表3 中華鱉群間遺傳距離分析Tab.3 The genetic distance among three different populations of wild Chinese soft-shelled turtle（T.sinensis）

3 討論

3.1 中華鱉群體遺傳分化分析

線粒體DNA 進化速度快，種群間的遺傳差異容易測出，已成為種內(nèi)和種間鑒定的良好標記。群體間的遺傳距離是衡量群體遺傳分化的重要指標[13]。根井正利[14]利用遺傳距離數(shù)值定量估計了物種的不同分類單位間的遺傳分化水平，指出種群間遺傳距離值的范圍是0～0.05，亞種間是0.02～0.2。本研究中，三個中華鱉群體間的遺傳距離均在0.05 以下，說明三個群體之間的遺傳分化還處于群間水平；而太湖花鱉群體與太湖鱉群體和洪澤湖鱉群體之間的遺傳距離均高于0.02，表明其群體間的遺產(chǎn)分化已達亞種間水平。MGEA 軟件聚類分析發(fā)現(xiàn)，中華鱉三個群體明顯分為兩支，太湖花鱉群體單獨聚類，太湖鱉群體和洪澤湖鱉群體混合聚類，但也發(fā)現(xiàn)太湖鱉群體和洪澤湖鱉群體有一定的分化趨異。

太湖花鱉屬于中華鱉的地方特色品種，與中華鱉常規(guī)品種在形態(tài)上存在較大差異（圖1），本文則是從基因?qū)用鎸Υ吮硇筒町悾催z傳分化已經(jīng)達到亞種間水平予以了揭示。這也與韓曉磊等[15]基于AFLP 分子標記技術(shù)對太湖流域中華鱉花鱉群體和普通群體的研究結(jié)果相一致。當然，太湖花鱉群體與太湖鱉群體和洪澤湖鱉群體之間分化水平的確定，還需要更多方面的研究予以論證。

Levinton 等[16]認為不同地區(qū)的生境差異（溫度、鹽度和洋流等）是產(chǎn)生和保持地理群體間遺傳結(jié)構(gòu)差異的重要因素。太湖鱉群體和洪澤湖鱉群體分屬于太湖流域和淮河流域，然而太湖和洪澤湖之間無明顯的地理屏障隔離，其間有水系相連通，加之中華鱉活動能力較強且水陸兼可，致使太湖鱉群體和洪澤湖鱉群體之間雖然表現(xiàn)了一定的遺傳分化趨勢，但其分化水平不高，也僅限于不同群體之間的遺傳差異。

3.2 中華鱉群體的遺傳多樣性分析

生物群體的遺傳多樣性是評價生物資源狀況的重要依據(jù)，是物種適應(yīng)多變的環(huán)境，維持長期生存和進化的遺傳基礎(chǔ)[17]。應(yīng)用線粒體DNA 測序技術(shù)研究物種的遺傳多樣性時，核苷酸多樣性（π）是衡量一個群體線粒體DNA 的遺傳變異程度的重要指標[18]。Nei 等[19]認為，群體內(nèi)兩個隨機選取的線粒體DNA 序列間核苷酸多樣性（π）值越小，群體的遺傳多樣性越低。Lan 等[20]也認為，當π 值在0.0015～0.0047 時，群體的遺傳多樣性較低。本研究中，中華鱉洪澤湖群體、太湖花鱉群體和太湖鱉群體的核苷酸多樣性（π）分別為0.0046、0.0031 和0.0014，π 值均小于0.0047，說明以上三個中華鱉群體的遺傳多樣性水平較低，且基本處于同一水平。三個中華鱉群體的群內(nèi)和群間的基因序列同源性結(jié)果支持了以上結(jié)論。

中華鱉向來是我國名貴的食物和藥材，隨著近代中華鱉人工養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速[21]，造成野生甲魚被大量捕獲用于食用與養(yǎng)殖，導致了自然種群混雜，群體多樣性不斷降低，中華鱉種質(zhì)嚴重退化，野外個體數(shù)量不斷減少[22]。世界自然保護聯(lián)盟（IUCN）日前發(fā)布的最新版全球瀕危物種紅色名錄，已將中華鱉列入瀕危物種名單[23]。基于以上因素必然導致中華鱉野外種群形成小群體，加速了繁殖群體的日益縮小，增加了近交頻率的發(fā)生，容易出現(xiàn)小群體效應(yīng)，最終造成三個中華鱉群體遺傳多樣性處于較低水平，這也從基因水平說明了其處于瀕危狀態(tài)的現(xiàn)狀，這也要求我們必須重視并開展對中華鱉野生群體遺傳多樣性的保護工作。