武紅，張曦輝，王軍，張占薪，雷娜

(鄭州人民醫(yī)院婦科,河南 鄭州 450003)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中3種主要惡性腫瘤類型之一，其臨床治療以腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)為基礎(chǔ)，在紫杉醇和鉑類聯(lián)合化療的6～8個(gè)療程的輔助下，完全緩解率可達(dá)到70%～80%[1-2]，而順鉑是最廣泛使用的化學(xué)療法之一[3]。卵巢癌患者預(yù)后差和死亡率高的部分原因是他們對(duì)鉑類化學(xué)療法的反應(yīng)較差，因此了解卵巢癌患者耐藥性發(fā)生和逆轉(zhuǎn)的潛在機(jī)制對(duì)于提高生存率和改善這些患者的預(yù)后具有重要的臨床意義。

microRNA可通過(guò)起抑癌基因或癌基因的作用，促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展[4]。FOXM1是一種與增殖相關(guān)的促癌轉(zhuǎn)錄因子，在包括卵巢癌等多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)增加[5]，通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)基因表達(dá)可共同調(diào)控卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。相關(guān)研究表明，高表達(dá)FOXM1可增強(qiáng)多種藥物的抗腫瘤作用[6]。本文旨在探究miR-509-3p通過(guò)靶向FOXM1對(duì)人卵巢癌順鉑耐藥SKOV3/DDP細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI 1640)培養(yǎng)基(61870-127)、胎牛血清(26400-036)、青-鏈霉素(15140-122)、胰蛋白酶(25200-056)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；LipoRNAiTM轉(zhuǎn)染試劑(C0535)、CCK-8試劑盒(C0037)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1062S)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012S)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；熒光素酶(L7840)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Solarbio公司；Anti FOXM1(ab180710)、ACTIN(ab8227)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3和人卵巢癌順鉑耐藥SKOV3/DDP細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所(ATCC)，將細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，添加10%(φ)胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素，置于37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，1∶2傳代。選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。

1.3 RT-PCR

用Trizol法從SKOV-3和SKOV3/DDP細(xì)胞中提取總RNA，用Nanodrop分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值(A260/A280)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成和PCR的擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán); 72 ℃延長(zhǎng)10 min。存儲(chǔ)在4 ℃條件下。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。以ACTIN為內(nèi)參，用2-△△Ct方法計(jì)算。miR-509-3p F為：5′-UGA UUGGUACGUCUGUGGGUAGTT-3′，R為：5′-CUA CCCACAGACGUACCAAUCATT-3′。FOXM1 F為：5′-GCCAACCGCTACTTGACATT-3′，R為：5′-TTG ATGGGTCTCGCTAAGTGT-3′。ACTIN F為：5′-ACT CTTCCAGCCTTCCTTCCT-3′，R為：5′-GTGATCTCC TTCTGCATCCTGT-3′。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

將SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-509-3p mimic，細(xì)胞隨機(jī)分為3組：Control組、mimic-NC組和miR-509-3p mimic組。將SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-509-3p inhibitor，細(xì)胞隨機(jī)分為3組：Control組、inhibitor-NC組和miR-509-3p inhibitor組。RT-PCR檢測(cè)miR-509-3p表達(dá)。

1.5 Western blot

取各組細(xì)胞用BCA試劑盒提取總蛋白并測(cè)定蛋白質(zhì)含量。提取等量的蛋白質(zhì)樣品100 ℃變性5 min。用SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在4 ℃條件下加入相應(yīng)一抗：FOXM1(1∶1000)并孵育過(guò)夜，清洗，然后在4 ℃下加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000)，孵育2 h，最后加入發(fā)光液，曝光處理。ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)灰度值。

1.6 CCK-8

將SKOV3/DDP細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞接種于96孔板(100 μL/孔)孵育24 h后，用不同劑量(0、0.5、1、2.5、5、10、25、50)DDP處理細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育4 h，在450 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定A值。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集各組細(xì)胞，以1×105接種于6孔板，每孔細(xì)胞懸液1 000 μL。置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按方法“1.4”進(jìn)行處理。處理后收集細(xì)胞至1.5 mL離心管中，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌3次(1 000 r/min，離心5 min)，棄上清，加入50 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，再分別加入1 μL Annexin V-FITC和2 μL碘化丙啶染色液(PI)，混勻后避光孵育20 min，每支離心管加入預(yù)冷的PBS緩沖液150 μL，混勻后用流式細(xì)胞儀分析。

1.8 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

通過(guò)PCR擴(kuò)增出含有miR-509-3p結(jié)合位點(diǎn)的FOXM13′UTR序列，將該序列克隆到pGL3-basic載體中, 命名為pGL3-FOXM13′UTR載體。通過(guò)基因定點(diǎn)誘變構(gòu)建出pGL3-FOXM13′UTRmut載體，作為陰性對(duì)照，然后將pGL3-FOXM13′UTR或pGL3-FOXM13′UTRmut載體與miR-509-3p mimic或mimic NC，連同pRL-TK載體共轉(zhuǎn)染至皮層神經(jīng)元細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.9 過(guò)表達(dá)FOXM1

構(gòu)建FOXM1 pcDNA載體過(guò)表達(dá)FOXM1轉(zhuǎn)染至SKOV3/DDP細(xì)胞，RT-PCR和Western blot驗(yàn)證是否過(guò)表達(dá)成功。選擇SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimic或聯(lián)合轉(zhuǎn)染pcDNA-FOXM1將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：Control組、miR-509-3p組、mimic+pcDNA組和mimic+FOXM1組，蛋白免疫印跡檢測(cè)FOXM1蛋白表達(dá)水平，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-509-3p、FOXM1表達(dá)水平

通過(guò)RT-PCR檢測(cè)miR-509-3p、FOXM1在卵巢癌細(xì)胞SKOV3和順鉑耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP中表達(dá)情況結(jié)果如圖1所示，與SKOV3細(xì)胞比較，SKOV3/DDP細(xì)胞miR-509-3p水平顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)OXM1水平顯著升高(P<0.05)。

與SKOV3細(xì)胞比較，*P<0.05

2.2 SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-509-3p mimic和SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-509-3p inhibitor對(duì)miR-509-3p、FOXM1表達(dá)水平及細(xì)胞存活率的影響

將SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-509-3p mimic，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)miR-509-3p、FOXM1表達(dá)水平，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率結(jié)果如圖2ACE所示，與Control組比較，miR-509-3p mimic組miR-509-3p水平顯著升高(P<0.05)，F(xiàn)OXM1水平顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)；將SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-509-3p inhibitor，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)miR-509-3p、FOXM1表達(dá)水平，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率結(jié)果如圖2所示，與Control組比較，miR-509-3p inhibitor組miR-509-3p水平顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)OXM1水平顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)。

2.3 miR-509-3p對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況結(jié)果如圖3所示，在SKOV3/DDP細(xì)胞中，與Control組比較，miR-509-3p mimic組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；在SKOV3細(xì)胞中，與Control組比較，miR-509-3p inhibitor組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。

與Control組比較，*P<0.05

與Control組比較，*P<0.05

2.4 FOXM1與miR-509-3p靶向關(guān)系

通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)FOXM1與miR-509-3p靶向關(guān)系結(jié)果如圖4A所示，luc-FOXM1加入miR-509-3p處理后熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；構(gòu)建FOXM1 pcDNA載體過(guò)表達(dá)FOXM1轉(zhuǎn)染至SKOV3/DDP細(xì)胞，RT-PCR和Western blot檢測(cè)FOXM1 mRNA水平及蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖4BC所示，與Control組比較，pcDNA-FOXM1組FOXM1 mRNA水平及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；通過(guò)Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞FOXM1蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖4D所示，與Control組比較，miR-509-3p mimic組FOXM1蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與mimic+pcDNA組比較，mimic+FOXM1組FOXM1蛋白水平顯著升高(P<0.05)。

2.5 miR-509-3p靶向FOXM1對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞存活率和凋亡的影響

通過(guò)CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力結(jié)果如圖5A所示，與Control組比較，miR-509-3p mimic組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。與mimic+pcDNA組比較，mimic+FOXM1組細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡結(jié)果如圖5B所示，與Control組比較，miR-509-3p mimic組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。與mimic+pcDNA組比較，mimic+FOXM1組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

3 討論

由于卵巢癌細(xì)胞在化療過(guò)程中極易發(fā)生耐藥效應(yīng)，由于化療耐藥性的產(chǎn)生，半數(shù)以上患者在常規(guī)治療后仍然出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，5年生存率低于30%[7]。雖然順鉑是治療婦科惡性腫瘤最有效的化療藥物之一，但卵巢癌對(duì)順鉑耐藥是化療失敗的最主要原因[8]。尋找卵巢癌細(xì)胞耐藥的原因給予其有效的靶向治療是現(xiàn)階段面臨的一個(gè)重要問(wèn)題。

與Control組比較：*P<0.05；與mimic+pcDNA組比較：#P<0.05

與Control組比較：*P<0.05；與mimic+pcDNA組比較：#P<0.05

近年來(lái)的研究表明，除了基因遺傳和表觀遺傳外，耐藥機(jī)制也可能受到miRNA調(diào)控。miR-509-3p在頭頸鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤中發(fā)揮著腫瘤抑制因子的作用[9]。Chen W等[10]研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)miR-509-3p可下調(diào)卵巢癌細(xì)胞X連鎖凋亡抑制蛋白的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞增殖，增加化療藥物的敏感性。Niu等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-509-3p可能靶GOLPH3和WLS基因，進(jìn)而提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)鉑類化療藥物的敏感性。

腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞增殖與凋亡失衡是產(chǎn)生耐藥性的一個(gè)重要機(jī)制，而一些miRNA異常表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮作用，已有研究表明miRNA對(duì)凋亡信號(hào)通路的調(diào)控與卵巢癌耐藥性形成有關(guān)[12-13]。本文研究發(fā)現(xiàn)，miR-509-3p在SKOV3/DDP細(xì)胞中低表達(dá)，在SKOV3細(xì)胞中高表達(dá)，且轉(zhuǎn)染mimic后促進(jìn)SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞存活，轉(zhuǎn)染inhibitor后抑制SKOV3細(xì)胞凋亡，升高細(xì)胞活力。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-509-3p可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

FOXM1是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族成員，具有介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞異常增殖、新生血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞逃逸衰老等效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[14]。過(guò)表達(dá)FOXM1在順鉑敏感的卵巢癌細(xì)胞增加順鉑耐藥和腫瘤球形成[15]，表明高表達(dá)FOXM1可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥。陳國(guó)慶等[16]研究發(fā)現(xiàn)抑制FOXM1表達(dá)可抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FOXM1 mRNA水平在SKOV3/DDP細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，在SKOV3細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-509-3p mimic后FOXM1蛋白表達(dá)下調(diào)，SKOV3轉(zhuǎn)染miR-509-3p inhibitor后FOXM1蛋白表達(dá)上調(diào)，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)FOXM1與miR-509-3p存在直接靶向作用關(guān)系。SKOV3/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-509-3p mimic并聯(lián)合轉(zhuǎn)染pcDNA-FOXM1下調(diào)SKOV3/DDP細(xì)胞FOXM1蛋白表達(dá)水平，升高存活率，抑制細(xì)胞凋亡。提示miR-509-3p靶向FOXM1逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細(xì)胞順鉑耐藥。

綜上所述，miR-509-3p通過(guò)靶向FOXM1升高SKOV3/DDP細(xì)胞存活率，抑制細(xì)胞凋亡增強(qiáng)對(duì)順鉑的敏感性。本實(shí)驗(yàn)為卵巢癌化療耐藥治療提供新的方向, miR-509-3p可作為卵巢癌的潛在治療靶點(diǎn)。