胡子旋，蔡大可，李鈺婷1,，黃雪君，甘海寧，黃丹娥，姚楠，陳玉興*

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405； 2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095； 3.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州 510095)

炎癥是機體抵御生理應(yīng)激的基本防御機制，常見于組織創(chuàng)傷、感染性或缺血性疾病以及代謝紊亂、自身免疫應(yīng)激等各種疾病過程中[1-2]。適度的炎癥可以清除損傷組織，啟動防御性愈合，恢復(fù)機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，但過強的炎癥反應(yīng)也會引起機體損傷，加重疾病過程[3-4]。白楊素是黃酮類化合物中最具生物活性的成分之一，有文獻表明白楊素具有較強的抗炎、抗氧化等藥理活性[1,5]，其抗炎機制與消除細胞中的活性氧及調(diào)控NF-κB通路有關(guān)[6]，但是白楊素的抗炎作用是否與其調(diào)控自噬過程相關(guān)，未見報道。

自噬是真核細胞中的一種高度保守的分解代謝過程，其在能量匱乏時重新利用細胞內(nèi)成分獲取能量，在應(yīng)激條件下吞噬有害蛋白和細胞器，形成一種對抗細胞內(nèi)病原體的重要防御機制[7-8]。有文獻報道了自噬作為細胞保護方式參與機體免疫和炎癥調(diào)控的機制[9]，有利于成為拓展開發(fā)抗炎藥物的新靶點。microRNA是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，可以通過靶向調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)錄進而調(diào)節(jié)自噬過程的不同階段[8]，在疾病的預(yù)防與治療中發(fā)揮著重要作用。本研究著重評估自噬以及自噬相關(guān)microRNA與白楊素抗炎作用的相關(guān)性，為深入探索白楊素抗炎作用提供基因水平和表觀遺傳學(xué)方面的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

RAW264.7小鼠巨噬細胞系購自上海中科院細胞庫。純度為98.5%的白楊素(北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司，中國，批號BW5648)；脂多糖(LPS，廣州奕元生物技術(shù)有限公司，中國，批號20200115)；二甲亞砜(DMSO，上海生工生物工程有限公司，中國，批號EB26BA0032)；MEM-alpha高糖培養(yǎng)基(Gibco公司，美國，批號8118414)；胎牛血清(Bovogen公司，澳大利亞，批號1909A)；Penicillin-Streptomycin Solution雙抗(上海生工生物工程有限公司，中國，批號G402FA0002)；CCK8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，中國，批號616A011)；總RNA提取試劑Trigol(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，中國，批號NEP019-2)；RT-qPCR試劑盒(TaKaRa公司，日本，批號1904856A)；Mir-XTMmiRNA試劑盒(TaKaRa公司，日本,批號1809671A)。

1.2 主要儀器

細胞培養(yǎng)箱(ThermoFisher公司，美國)；Bio-RAD全自動酶標儀(ThermoFisher公司，美國)；IQ5熒光定量PCR儀(ThermoFisher公司，美國)；CKX41型倒置顯微鏡(奧林巴斯，日本)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 使用含有10%(φ)胎牛血清與1%雙抗的MEM-alpha培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細胞。將細胞置于37 ℃、5%(φ)CO2恒溫培養(yǎng)箱中，每隔24 h置于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.3.2 細胞活性檢測 將RAW264.7細胞接種于96孔板，調(diào)節(jié)細胞濃度為104/mL孔，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。白楊素純度為98.5%，摩爾質(zhì)量為254.24，稱取9.6 mg的白楊素溶于185 μL DMSO溶液中，配成200 μmol/L的白楊素溶液。將白楊素用MEM-alpha培養(yǎng)基稀釋成不同藥物濃度(0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L)。更換細胞培養(yǎng)液，加入不同濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入CCK8試劑10 μL/孔，培養(yǎng)1 h后用酶標儀檢測在562 nm波長下各孔的A(λ)值，計算存活率。

存活率=實驗組A(λ)均值/對照組A(λ)均值×100%

1.3.3 實時定量熒光PCR檢測 將4×105/mL的RAW264.7細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液，設(shè)置空白對照組，LPS模型組(0.1 μg/mL)，LPS+白楊素高、中、低劑量組，每組設(shè)3個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去上清，Trigol處理細胞樣品，提取總RNA，按照PCR試劑盒說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

將1 μL cDNA、11 μL ddH2O、0.25 μL前引物F、0.25 μL后引物R、12.5 μL SYBRGreen、0.5 μL ROX混合后，以94 ℃×5 min→94 ℃×30 s→5 ℃×30 s→72 ℃×50 s(45個循環(huán))；72 ℃×7 min進行擴增,運用2-ΔΔCt法計算基因表達量。引物設(shè)計利用Primer 5.0生物軟件，基因的引物由上海英濰捷基公司合成，引物序列如表1所示。

1.3.4 microRNA 檢測方法 總RNA提取方法同“1.3.3”，按照microRNA試劑盒說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將2 μL cDNA、9 μL ddH2O、0.5 μL特異引物、0.5 μL通用引物Mrq3'primer、12.5 μL SYBR Green、0.5 μL ROX混合后，以95 ℃×10 s→ 95 ℃×5 s→ 60 ℃×20 s→ 95 ℃×60 s→ 55 ℃×30 s(40個循環(huán))；60 ℃進行擴增,運用2-ΔΔCt法計算基因表達量。引物由Takara公司合成，引物序列如表2所示。

表1 擴增的基因引物信息

表2 microRNA引物序列

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 由IBM SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較，方差齊采用SNK法，方差不齊采用DunnettT3檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白楊素對RAW264.7細胞存活率的影響

CCK8檢測不同濃度白楊素對Raw264.7細胞的毒性。結(jié)果如圖1，細胞存活率隨著白楊素濃度的升高而降低，12.5～200 μmol/L時細胞存活率低于90%，6.25 μmol/L時對RAW264.7細胞活力沒有顯著影響，可作為白楊素抗炎及機制的安全濃度范圍。因此實驗采用5、0.5、0.05 μmol/L濃度作為白楊素高、中、低劑量。

2.2 白楊素對炎癥和自噬相關(guān)基因表達水平的影響

白楊素對炎癥相關(guān)基因的影響如圖2。與空白組相比，LPS組中IL-1β、IL-6、COX-2、iNOS基因表達顯著上升(P<0.05或P<0.01)，藥物干預(yù)后，IL-1β、IL-6、COX-2、iNOS的表達水平顯著下降(P<0.05或P<0.01)；與空白組相比，模型組IL-5、IL-10基因表達明顯下降(P<0.05)，白楊素給藥組中IL-5、IL-10有明顯上調(diào)作用(P<0.05)。

自噬相關(guān)基因表達結(jié)果如圖3。與模型組相比，白楊素組能明顯上調(diào)beclin1、ULK1、LC3B、ATG5、ATG4B基因的表達(P<0.05或P<0.01)。

圖1 白楊素對RAW264.7細胞存活率的影響

2.3 白楊素對microRNA表達的影響

自噬相關(guān)microRNA的表達結(jié)果如圖4。與空白組相比，模型組miR-26a-5p、miR-30e-5p、miR-124-3p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-204-5p的表達顯著上升(P<0.05或P<0.01)；與模型組相比，白楊素組miR-26a-5p、miR-30e-5p、miR-124-3p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-204-5p的表達顯著下降(P<0.05或P<0.01)，并呈現(xiàn)濃度依賴性。

與空白組比較：#P<0.05,##P<0.01; 與模型組比較：*P<0.05,**P<0.01。

與空白組比較：#P<0.05,##P<0.01; 與模型組比較：*P<0.05,**P<0.01。

與空白組比較：#P<0.05,##P<0.01; 與模型組比較：*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

巨噬細胞是一種具有較強的可塑性和異質(zhì)性的細胞群體，在不同微環(huán)境下分化成具有不同生物學(xué)特性和功能的亞型，主要可分為M1和M2型。M1型巨噬細胞通過IFN-γ和脂多糖LPS活化，產(chǎn)生促炎因子(如IL-1β、IL-6)，引發(fā)免疫反應(yīng)，同時可激活炎癥相關(guān)酶類(iNOS、COX-2)，加劇對健康有害的炎癥過程；M2型巨噬細胞通過Th2免疫應(yīng)答分泌抗炎因子IL-10和TGF-β，抑制炎癥反應(yīng)，減少促炎因子引起的組織損傷[10-11]。本研究結(jié)果顯示白楊素能顯著降低IL-1β、IL-6、COX-2、iNOS的基因水平，抑制巨噬細胞的炎癥反應(yīng)，顯示出良好的抗炎活性。同時白楊素能上調(diào)抗炎因子IL-10和調(diào)節(jié)因子IL-5的表達水平，促進組織修復(fù)而減少炎癥反應(yīng)，提示白楊素能夠促進RAW264.7細胞向M2轉(zhuǎn)化。結(jié)果中白楊素調(diào)控IL-5、IL-10等炎癥因子不呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，可能由于這些炎癥因子的調(diào)控不屬于白楊素的直接靶點，是白楊素多靶點調(diào)控巨噬細胞的結(jié)果。

鑒于自噬與巨噬細胞中炎癥的調(diào)控有著密切的關(guān)系[12]，因此推測白楊素的抗炎機制與自噬相關(guān)。自噬體的形成是多種基因共同調(diào)控的結(jié)果，特別是自噬的激活以及自噬通量對于減少炎癥的損傷有關(guān)鍵意義[13]。本實驗將beclin1、ULK1、LC3B、ATG5、ATG4B作為自噬啟動的檢測指標，研究白楊素調(diào)控炎癥的分子機制。有研究表明白楊素可通過抑制mTOR從而激活自噬，發(fā)揮抗炎作用[14]。同時有報道PI3K/Akt-Beclin1通路負向調(diào)節(jié)NF-κB依賴的炎癥反應(yīng)從而抑制TNF-a、IL-1β的產(chǎn)生[15]。本實驗中也發(fā)現(xiàn)白楊素發(fā)揮抗炎作用的同時上調(diào)了炎癥模型中自噬基因的表達，說明在巨噬細胞的抗炎調(diào)控中與文獻報道機制相似。在脂多糖刺激的巨噬細胞中，iNOS可與自噬受體p62相互作用并共定位，同時可與LC3部分共定位，作為自噬底物被招募到自噬體進行降解[16]。本實驗結(jié)果中LC3B表達量與iNOS表達量變化趨勢相反，本實驗結(jié)果驗證巨噬細胞通過自噬降解iNOS從而抑制炎癥反應(yīng)的機制，同時提示白楊素發(fā)揮抗炎藥理作用的分子機制與自噬相關(guān)基因的mRNA水平調(diào)控密切相關(guān)。綜上所述，在LPS所致炎癥過程中，自噬相關(guān)蛋白LC3B、beclin1、ATG5、ULK1、ATG4B等在轉(zhuǎn)錄階段已經(jīng)受到抑制，LPS可能抑制上述蛋白聚集而形成的自噬小體，特別是對于自噬小體囊膜構(gòu)成具有重要意義的LC3B、beclin1基因[17-18]，也使得后續(xù)發(fā)揮降解蛋白功效的自噬溶酶體無法形成。白楊素可能通過逆轉(zhuǎn)LPS所致自噬抑制的機制而發(fā)揮抗炎作用，而自噬相關(guān)mRNA受到抑制的原因可能與調(diào)控mRNA水平的因素相關(guān)，為了進一步探索其機制，本研究從負性調(diào)控mRNA的microRNA進行了探索。

白楊素顯著調(diào)控與自噬啟動、生成相關(guān)的mRNA，而microRNA對mRNA具有負性調(diào)控作用，能夠在細胞質(zhì)內(nèi)降解目標mRNA[8]，于是檢測了多個自噬相關(guān)microRNA(如表3)。結(jié)果表明白楊素可下調(diào)miR-26a-5p、miR-30e-5p、miR-124-3p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-204-5p表達水平，而且白楊素對于microRNA的調(diào)控呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)ULK1是miR-26a-5p的一個重要靶點，miR-26a-5p通過抑制ULK1的表達而抑制自噬的啟動[19]。在雙膜延伸階段，miR-124-3p能夠直接作用于beclin1而下調(diào)自噬水平，阻止吞噬泡的形成[18]。miR-204-5p能靶向調(diào)控LC3B，從而影響自噬體的形成[20]。可見多個microRNA調(diào)節(jié)著自噬過程的不同階段，研究結(jié)果中白楊素調(diào)控多個microRNA，也提示白楊素的作用機制可能是多靶點的，與多個通路相關(guān)的。本研究提示白楊素作為黃酮類成分具有多靶點調(diào)控的特點，與文獻報道有類似的地方[1]。鑒于表觀遺傳學(xué)角度探討白楊素抗炎作用的報道較少見，本研究從microRNA和mRNA關(guān)聯(lián)調(diào)控著手，為深入剖析白楊素調(diào)控的關(guān)鍵靶點提供前期基礎(chǔ)。

本研究從microRNA和mRNA的水平上探索了白楊素調(diào)控自噬與抑制炎癥的相關(guān)性，但確切的關(guān)聯(lián)機制及關(guān)鍵信號通路有待挖掘。

綜上所述，白楊素能有效抑制RAW264.7細胞的炎癥反應(yīng)，同時白楊素發(fā)揮抗炎作用可能是調(diào)控自噬相關(guān)mRNA和microRNA共同作用的結(jié)果。

表3 microRNA對應(yīng)調(diào)控的基因靶點及其功能