王碧君，黃上書，梁慧，楊文惠，羅宇琴，孫冬梅，陳向東

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244)

山藥為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb. 的干燥根莖，主要分布于山西，河北安國，陜西朝邑、華縣、同州，河南新鄉(xiāng)等地，以河南為道地產(chǎn)區(qū)。山藥作為藥食兩用佳品，味甘，性平，具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精之功，臨床用于脾虛食少、肺虛喘咳、腎虛遺精、虛熱消渴等癥[1]。山藥生品長于補(bǔ)虛，麩炒后健脾和胃功效增強(qiáng)，臨床上麩炒山藥主要作為滋陰或補(bǔ)陽的臣藥，功偏補(bǔ)益[2-6]?，F(xiàn)代研究表明，山藥主要含有山藥多糖、黃酮、山藥堿、尿囊素、腺苷、甾體化合物等成分[7-8]，具有抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血糖的作用。

目前，2015年版《中國藥典》對山藥的質(zhì)量控制缺乏有效成分的限定，本研究對不同產(chǎn)地山藥及其麩炒品進(jìn)行研究，建立山藥和麩炒山藥飲片尿囊素的HPLC含量測定方法，及山藥和麩炒山藥飲片UPLC指紋圖譜方法及腺苷的含量測定方法，并結(jié)合相似度分析對山藥及其炮制品的指紋圖譜差異進(jìn)行評價(jià)，為全面評價(jià)山藥的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀；Waters H-class超高效液相色譜儀；ME204E萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多公司)；XP26百萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多公司)；KQ500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

乙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)、甲醇(廣東光華科技股份有限公司)為分析純；乙腈(默克股份有限公司)、磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)為色譜純；水為超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。腺苷(批號110879-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%，中國食品藥品檢定研究院)；尿囊素(批號111501-200202，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%，中國食品藥品檢定研究院)；麩皮(批號FH1810001，溫縣三方農(nóng)貿(mào)有限公司)。

10批山藥生品來源于全國不同產(chǎn)地，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖。麩炒山藥為同批山藥的炮制加工品，炮制工藝：每100 kg山藥片用麩皮10～15 kg。樣品采集信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 山藥及麩炒山藥指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：YMC Triart 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～4 min，1%A；4～10 min，1%→3%A；10～25 min，3%→20%A)；流速：0.20 mL/min；柱溫：30 ℃，檢測波長：258 nm；進(jìn)樣量：1 μL。

表1 樣品信息

2.1.2 供試品溶液的制備 取飲片粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇15 mL，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，離心，取上清液，殘?jiān)偌尤?0%甲醇10 mL，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，離心，合并2次上清液，定容至25 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 對照品溶液的制備 取腺苷對照品適量，加10%甲醇制成質(zhì)量濃度為0.227 mg/mL的對照品溶液。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 日內(nèi)精密度：取同一批飲片粉末(S1)，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，并按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以1號腺苷色譜峰為參照峰S，計(jì)算得到各共有峰相對峰面積及相對保留時(shí)間RSD值均小于1.0%，表明儀器精密度良好。日間精密度：取同一批飲片粉末(S1)，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別在不同日期內(nèi)按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，以腺苷峰為參照峰S，計(jì)算得到各共有峰相對峰面積及相對保留時(shí)間RSD值均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批飲片粉末(S1)，按“2.1.2”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，并按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件依此進(jìn)樣測定，以腺苷峰為參照峰S，計(jì)算得到各共有峰相對峰面積及相對保留時(shí)間RSD值均小于2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批飲片粉末(S1)，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測定，以腺苷峰為參照峰S，計(jì)算得到各共有峰相對峰面積及相對保留時(shí)間RSD值均小于2.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 UPLC指紋圖譜的建立 取上述10批山藥生品和10批麩炒山藥飲片，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，并按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件測定。使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》進(jìn)行分析，采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行自動(dòng)匹配(時(shí)間窗0.1 min)，提取吸收信號較強(qiáng)、峰形明顯、穩(wěn)定性較好的共有峰，按中位數(shù)法生成對照圖譜，結(jié)果見圖1～4。

根據(jù)數(shù)據(jù)分析，10批山藥生品標(biāo)定了4個(gè)共有峰，10批麩炒山藥飲片標(biāo)定了7個(gè)共有峰，2號峰為腺苷峰，其分離度良好，峰面積較大，在圖譜中較穩(wěn)定且為所有樣品共有，所以確定腺苷為參照峰(S)。

圖1 10批山藥生品的UPLC疊加圖譜

2.1.8 指紋圖譜相似度計(jì)算 分別通過10批山藥和麩炒山藥生成的共有模式為對照指紋圖譜，計(jì)算各批次之間的相似度，結(jié)果見表2。可見，10批次山藥生品與對照指紋圖譜的相似度范圍為0.997～1.000，10批次麩炒山藥飲片與對照指紋圖譜的相似度范圍為0.950～0.999，表明山藥與麩炒山藥質(zhì)量穩(wěn)定，生品與生品、炮制品與炮制品之間組內(nèi)組成成分差異小。

圖2 10批麩炒山藥樣品的UPLC疊加圖譜

圖3 山藥生品對照指紋圖譜

圖4 麩炒山藥樣品對照指紋圖譜

2.1.9 山藥麩炒前后UPLC指紋圖譜比較 取炮制用輔料麩皮，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，并按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件測定，將圖譜結(jié)果與上述山藥、麩炒山藥UPLC指紋圖譜進(jìn)行比較，結(jié)果見圖5。

表2 山藥生品及麩炒山藥飲片相似度

圖5 山藥麩炒前后UPLC指紋圖譜比較

可見，麩炒后的山藥圖譜由5個(gè)共有峰增加至8個(gè)共有峰，其主要差異在a、b、c 3個(gè)區(qū)域。其中，a所示區(qū)域麩炒品中明顯增加了峰3，而山藥生品在該積分條件下未能識別，且輔料麥麩中響應(yīng)極低；b所示區(qū)域麩炒品中明顯增加了峰5，而山藥生品在該積分條件下未能識別，且輔料麥麩中無響應(yīng)；c所示區(qū)域麩炒品中明顯增加了峰8，而山藥生品在該積分條件下未能識別，且輔料麥麩中響應(yīng)較低，進(jìn)一步說明了麩炒前后山藥與麩炒山藥差異較大，表明該指紋圖譜方法能應(yīng)用于山藥與麩炒山藥的質(zhì)量控制。

2.2 腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定方法

2.2.1 供試品溶液的制備 同“2.1.2”項(xiàng)下方法。

2.2.2 對照品溶液的制備 同“2.1.3”項(xiàng)下方法。

2.2.3 色譜條件 同“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件。分別精密吸取腺苷對照品、山藥(S1)供試品和麩炒山藥(S11)供試品溶液 1 μL，進(jìn)樣測定，色譜圖見圖6。

A.腺苷對照品； B.山藥樣品； C.麩炒山藥樣品； 1.腺苷。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液適量，分別置10 mL容量瓶中，用10%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度分別為0.114、0.056 8、0.022 7、0.005 68、0.002 27、0.001 14 mg/mL的對照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積；以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=1.590×107x- 2.389×103，r=0.999 9，線性范圍為0.00 114～0.114 mg/mL。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 日內(nèi)精密度：取同一批飲片粉末(S1)，按“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，并按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得到腺苷峰面積RSD值為0.37%，表明儀器精密度良好。日間精密度：取同一批飲片粉末(S1)，按“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別在不同日期內(nèi)按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算得到腺苷峰面積RSD值為1.18%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批飲片粉末(S1)，按“2.2.1”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得到腺苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.337 mg/g，RSD值為0.37%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批供試品溶液(S1)，按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測定，計(jì)算得到腺苷峰面積的RSD值為0.71%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 回收率試驗(yàn) 取同一批(S1號)已知含量的樣品約0.25 g，精密稱定，按高、中、低3種濃度分別加入腺苷對照品溶液，分別“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。計(jì)算得到腺苷平均加樣回收率分別為104.65%，結(jié)果見表3。

表3 腺苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3 尿囊素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定方法

2.3.1 供試品溶液的制備 取飲片粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 對照品溶液的制備 取尿囊素對照品適量，加稀乙醇使溶解，定容至刻度，制成2.497 mg/mL尿囊素對照品儲備溶液。

2.3.3 色譜條件 色譜柱：Waters SPHERISORB NH2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-水(體積比90∶10)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：224 nm；進(jìn)樣量：10 μL。分別精密吸取尿囊素對照品、山藥(S1)供試品和麩炒山藥(S11)供試品溶液 10 μL，進(jìn)樣測定，色譜圖見圖7。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)對照品溶液適量，分別置5、10、10、20、10、25 mL容量瓶中，用稀乙醇稀釋至濃度，搖勻，制得質(zhì)量濃度分別為1.248、0.624、0.250、0.125、0.075、0.030 mg/mL的對照品溶液，分別按“2.3.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積；以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=1.824×106x+2.800×103，r=0.999 9，線性范圍為0.030 0～1.248 mg/mL。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 日內(nèi)精密度：取同一批飲片粉末(S1)，按“2.3.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，并按“2.3.3”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得到尿囊素峰面積RSD值為1.01%，表明儀器精密度良好。日間精密度：取同一批飲片粉末(S1)，按“2.3.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別在不同日期內(nèi)按“2.3.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算得到尿囊素峰面積RSD值為1.28%，表明儀器精密度良好。

A.尿囊素對照品； B.山藥樣品； C.麩炒山藥樣品； 2.尿囊素。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批飲片粉末(S1)，按“2.3.1”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得到尿囊素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.997 mg/g，RSD值為0.72%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批供試品溶液(S1)，按“2.3.3”項(xiàng)色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測定，計(jì)算得到尿囊素峰面積的RSD值分別為1.03%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 回收率試驗(yàn) 取同一批(S1號)已知含量的樣品約0.25 g，精密稱定，按高、中、低 3 種濃度分別加入尿囊素對照品溶液，分別按“2.3.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果計(jì)算得到尿囊素的平均加樣回收率分別為 96.17%，見表4。

2.4 樣品測定

基于上述建立的腺苷及尿囊素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法，對10批山藥和10批麩炒山藥樣品進(jìn)行測定，計(jì)算樣品中的腺苷、尿囊素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表5?？梢?，山藥生品、麩炒山藥飲片中腺苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.196～0.421、0.260～0.410 mg/g，尿囊素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.200～9.160、6.240～8.340 mg/g。

運(yùn)用SPSS22.0軟件對山藥生品和麩炒山藥尿囊素、腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果見表6?？梢姡剿幊粗魄昂竽蚰宜?、腺苷含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 尿囊素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表5 山藥生品及麩炒山藥飲片中腺苷與尿囊素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果

表6 山藥及麩炒山藥腺苷、尿囊素含量獨(dú)立樣本檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本文對山藥及麩炒山藥的含量測定方法及指紋圖譜進(jìn)行了研究，建立了山藥和麩炒山藥飲片UPLC指紋圖譜方法，可同時(shí)測定腺苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。由于尿囊素極性較大，在反相色譜柱上保留時(shí)間極短，參考文獻(xiàn)[9-10]選用氨基柱進(jìn)行研究，考察不同乙腈-水比例對尿囊素分離度的影響，當(dāng)乙腈-水比例為(體積比90∶10)時(shí)，能較好分離得到樣品中的尿囊素。

曾對不同提取方法(超聲、回流)及不同提取溶劑(甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇、稀乙醇)進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用10%甲醇超聲提取的色譜圖信息量最多，峰響應(yīng)較高，且腺苷提取較充分，故選用10%甲醇超聲提取腺苷及指紋圖譜；采用稀乙醇超聲提取時(shí)，尿囊素提取較充分，故選用稀乙醇超聲提取尿囊素。

麥麩含有黃酮類、尿囊素等多種成分，炮制過程可能會(huì)對山藥中尿囊素質(zhì)量分?jǐn)?shù)產(chǎn)生影響[11]，而本文結(jié)果顯示麩炒后尿囊素、腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不明顯，可能與麥麩在炒制過程中，麥麩起中間傳熱作用有關(guān)。楊連菊等[12]發(fā)現(xiàn)麩炒前后山藥中的尿囊素質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不大，與本文結(jié)論一致。另外，劉應(yīng)蛟等[13]比較不用炮制方法對山藥尿囊素、腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，發(fā)現(xiàn)麩炒后尿囊素、腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不明顯，而土炒后顯著增大，后續(xù)將對不同炮制方法下山藥有效成分的變化情況進(jìn)行研究。

本研究試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，麩炒后山藥特征峰數(shù)量增多，說明麩炒后山藥的成分出現(xiàn)一定的變化，在炮制輔料麥麩中能找到其增加3號、7號和8號色譜峰，不能找到5號色譜峰，說明麩炒后增加的3號、7號和8號色譜峰可能由麥麩帶入；而增加的5號色譜峰，可能因加熱引起某些成分的轉(zhuǎn)化。結(jié)合炒制前后質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果，推測麩制后補(bǔ)益作用的增強(qiáng)可能不依賴尿囊素、腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，而麩炒的作用可能使二者的質(zhì)量分?jǐn)?shù)維持在一定范圍內(nèi)發(fā)揮作用。另外，山藥歸脾、肺、腎經(jīng)，而麥麩含有豐富的氨基酸等成分，麩制后可能作為引經(jīng)藥促進(jìn)山藥對脾胃的親和力，增強(qiáng)其補(bǔ)脾益肺的功效。