郭彤彤 朱銘強(qiáng) 李晉鵬 郭新榮 賀 虹

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院 西部森林生物災(zāi)害治理國(guó)家林草局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 楊陵 712100； 2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)機(jī)械與電子工程學(xué)院 楊陵 712100)

杜仲(Eucomniaulmoides)是僅存于我國(guó)的第三紀(jì)孑遺植物，也是中國(guó)特有的重要經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，其樹(shù)皮、葉、花及其次生代謝物均是重要的藥用資源(張康健等， 2009)。同時(shí)，杜仲葉、樹(shù)皮和種子中富含的白色絲狀杜仲膠是一種天然高分子物質(zhì)“反式聚異戊二烯”，具有熱塑性、熱彈性和高彈性，廣泛應(yīng)用于交通、通訊、醫(yī)療、電力、國(guó)防等領(lǐng)域(嚴(yán)瑞芳， 1995)。橡膠工業(yè)是國(guó)民經(jīng)濟(jì)最為重要的基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)之一，而我國(guó)天然橡膠資源嚴(yán)重短缺。杜仲膠是除橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)之外世界上唯一具有開(kāi)發(fā)前景的優(yōu)質(zhì)天然橡膠資源，成為我國(guó)重要且緊缺的戰(zhàn)略物資。因此，大力培育杜仲資源，促進(jìn)杜仲膠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對(duì)于提升和優(yōu)化我國(guó)橡膠原材料結(jié)構(gòu)具有重要的戰(zhàn)略意義。

一般認(rèn)為杜仲是比較抗蟲(chóng)的樹(shù)種，但是隨著種植規(guī)模的擴(kuò)大，一種專(zhuān)門(mén)取食杜仲葉片的害蟲(chóng)杜仲夢(mèng)尼夜蛾(Orthosiasongi)(鱗翅目： 夜蛾科Noctuidae)暴發(fā)成災(zāi)，其食性專(zhuān)一，食葉量大，蔓延擴(kuò)散快，為害期長(zhǎng)，目前已成為杜仲產(chǎn)業(yè)最具威脅的生物災(zāi)害之一(李劍豪等， 1997； 趙陽(yáng)等， 2015)。杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)能夠取食消化杜仲葉片，完成正常的生長(zhǎng)發(fā)育，并將杜仲膠隨糞便排出(王俊雅等， 2016； 2017； 孫志強(qiáng)等， 2016)，而一些其他食葉昆蟲(chóng)如銀杏大蠶蛾(Dictyoplocajaponica)僅可取食少量杜仲葉，長(zhǎng)時(shí)間飼喂后幼蟲(chóng)不能正常發(fā)育，出現(xiàn)消化不良和死亡。因此，杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)消化道應(yīng)該具有適應(yīng)寄主和消化/降解杜仲膠的特殊代謝機(jī)制。

已知棲息于昆蟲(chóng)消化道的微生物參與宿主許多重要的生理活動(dòng)，如調(diào)節(jié)代謝、解毒、提供營(yíng)養(yǎng)、激發(fā)免疫反應(yīng)、影響宿主昆蟲(chóng)選擇行為和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性等(郭軍等， 2015； Paniaguaetal., 2018)。尤其在鱗翅目昆蟲(chóng)中，其腸道微生物的主要功能是協(xié)助宿主代謝，幫助降解食物中難消化成分、有毒或有害物質(zhì)(陳勃生等， 2017)。那么，杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)能夠取食和利用含膠的杜仲葉片是否與其腸道微生物有關(guān)，腸道微生物對(duì)其幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)利用產(chǎn)生何種影響，能否利用腸道微生物進(jìn)行杜仲膠的提取，這些都是亟待研究的科學(xué)問(wèn)題。

本研究對(duì)杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)消化道的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)與分子鑒定，并測(cè)定這些菌株對(duì)生物大分子物質(zhì)(纖維素、果膠和淀粉)和杜仲葉主要成分的降解能力，然后通過(guò)抗生素處理分析腸道菌群對(duì)其幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)利用的影響，研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究杜仲夢(mèng)尼夜蛾與寄主的協(xié)同進(jìn)化、害蟲(chóng)防治及資源利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)源采集及消化道解剖

2017年6月，從陜西省漢中市略陽(yáng)縣杜仲林采集杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)，選取健康的6齡幼蟲(chóng)，饑餓2 h后進(jìn)行消化道的解剖。解剖前，先將幼蟲(chóng)放置于冰箱(-15 ℃)冷凍至昏迷，取出后浸泡于體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精中進(jìn)行體表消毒2 min，經(jīng)無(wú)菌水漂洗3次后，在解剖鏡(德國(guó)萊卡EZ4D)下小心解剖出完整的消化道。所有解剖均在超凈工作臺(tái)完成，所用工具經(jīng)嚴(yán)格濕熱滅菌。將解剖出的單個(gè)消化道放入1.5 mL滅菌的離心管中，加入1 mL無(wú)菌水研磨混勻，制成腸液備用。重復(fù)5頭幼蟲(chóng)。

1.2 腸道細(xì)菌的分離培養(yǎng)和分子鑒定

采用平板法在LB培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)和大豆蛋白胨培養(yǎng)基(TSA)上進(jìn)行腸道細(xì)菌的分離培養(yǎng)(馬樂(lè)好等， 2005)。吸取制備好的腸液50 μL涂平板，每種培養(yǎng)基每頭幼蟲(chóng)各重復(fù)3個(gè)平板。將培養(yǎng)平板倒置放入30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，每天觀(guān)察記錄菌落數(shù)量和形態(tài)。用接種環(huán)挑取大小、顏色、形態(tài)不同的單菌落，在新的LB平板上劃線(xiàn)培養(yǎng)，得到純的單克隆菌株。

對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定，首先將純化的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床上(30 ℃，150 r·min-1)培養(yǎng)48 h，從每個(gè)菌株吸取2 mL菌液于新的離心管中進(jìn)行離心(12 000 r·min-1，2 min)； 棄上清，在沉淀中加入500 μL無(wú)菌水，混勻后放入金屬浴(95 ℃)中10 min，然后12 000 r·min-1離心2 min，上清液作為PCR模板備用。采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′) 和1492R (5′-TACGGYTACCTTGTT ACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系： Mix 12.5 μL，引物(10 μmol·L-1) 各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 補(bǔ)充體積至25 μL。PCR反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)； 最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物在1% 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，達(dá)到測(cè)序的濃度和純度后送奧科鼎盛生物公司進(jìn)行測(cè)序。

將獲得的菌株DNA序列進(jìn)行人工校對(duì)后，在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，下載相似性最高的相關(guān)微生物序列，然后利用ClustalX 2.1軟件進(jìn)行多重比對(duì)，并采用MEGA 6.0 軟件基于最理想的建樹(shù)模型構(gòu)建最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(Maximum likelihood tree)。相關(guān)菌株的DNA序列已上傳 GenBank，序列號(hào)為MK571186-MK571195。

1.3 腸道細(xì)菌對(duì)纖維素、果膠和淀粉的降解作用

為了分析10株細(xì)菌對(duì)生物大分子的降解能力，挑取其單菌落加入10 mL LB液體培養(yǎng)基中富集12 h，然后各吸取1 mL菌液分別接種于20 mL分別含有纖維素、果膠、淀粉的液體培養(yǎng)基中(夏曉峰， 2014； 薛志靜等， 2017)。將以上液體培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱，30 ℃培養(yǎng)3天，以不加菌的培養(yǎng)基作為對(duì)照。分別于培養(yǎng)24、36、48、60、72 h時(shí)吸取菌液2 mL，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液1 mL，釆用二硝基水楊酸法(DNS比色法)，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津UV-2450)檢測(cè)波長(zhǎng)為550 nm下的吸光值。測(cè)定數(shù)據(jù)采用Excel和Origin軟件進(jìn)行分析和作圖。

1.4 腸道細(xì)菌對(duì)杜仲葉成分的影響

采集新鮮的杜仲葉晾干后粉碎，稱(chēng)取10 g杜仲粉放入燒杯中，加入1 000 mL蒸餾水充分?jǐn)嚢?，分裝入10個(gè)50 mL三角瓶(各裝20 mL)中高壓滅菌(121 ℃，15 min)，即得杜仲液體培養(yǎng)基。分別在杜仲液體培養(yǎng)基中接入前期富集好的10株細(xì)菌液1 mL，不加菌的杜仲葉溶液作為對(duì)照，30 ℃培養(yǎng)，72 h后各吸取樣品2 mL，12 000 r·min-1離心10 min，取上清夜用0.22 μm濾膜過(guò)濾，取濾液在高效液相色譜儀(日立L2000)上檢測(cè)，比較分析接菌前后杜仲葉成分變化。

色譜條件： 色譜柱，Kromasil 100-5C18250 mm × 4.6 mm； 流動(dòng)相A為0.1%磷酸，流動(dòng)相B為甲醇； 流速1 mL·min-1； 檢測(cè)波長(zhǎng)200～400 nm； 柱溫30 ℃； 進(jìn)樣量2 μL。梯度洗脫程序： 0～6 min，A(%)6～6，B(%)94～94； 6～13 min，A(%)6～13，B(%)94～87； 13～22 min，A(%)13～20，B(%)87～80； 22～30 min，A(%)20～24，B(%)80～76； 30～45 min，A(%)24～35，B(%)76～65； 45～46 min，A(%)35～45，B(%)65～55； 46～60 min，A(%)45～50，B(%)55～50。

1.5 抗生素處理對(duì)杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響

為了揭示腸道菌群對(duì)杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)生長(zhǎng)和發(fā)育的影響，采用抑菌圈法和微量肉湯法，參照CLSI 藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(CLSI, 2012a; 2012b)，從10種抗生素(慶大霉素、紅霉素、鏈霉素、氯霉素、諾氟沙星、四環(huán)素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林、克拉霉素)中篩選出最適的抗生素及其濃度，確定1 μg·mL-1的氯霉素可基本清除幼蟲(chóng)的腸道細(xì)菌。

收集產(chǎn)卵時(shí)間一致的卵塊放置于培養(yǎng)皿中，獲得孵化期一致的初孵幼蟲(chóng)。將初孵幼蟲(chóng)放置于玻璃試管(φ=10 mm)中，每管2頭，共30管。將新鮮的杜仲葉用1 μg·mL-1氯霉素浸泡10 min，晾干后用打孔器(φ=10 mm)打成圓片，稱(chēng)重后飼喂15管幼蟲(chóng)，作為處理組； 用無(wú)菌水浸泡過(guò)的杜仲葉圓片飼喂另外15管幼蟲(chóng)，作為對(duì)照組。

每天定時(shí)進(jìn)行觀(guān)察、測(cè)量和稱(chēng)質(zhì)量，分別記錄幼蟲(chóng)的發(fā)育歷期、體長(zhǎng)、頭寬、幼蟲(chóng)體質(zhì)量、排糞量和取食量。按照以下公式計(jì)算各個(gè)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)(Thakuretal., 2016)：

幼蟲(chóng)相對(duì)生長(zhǎng)率(RGR)=G/(B×T)；

消耗指數(shù)(CI)=I/(B×T)， 食物利用率(ECI)=G/I；

食物轉(zhuǎn)化率(ECD)=G/(I-F)， 近似消耗率(AD)=(I-F)/I。

式中，G為蟲(chóng)體質(zhì)量增加值(即G=飼后幼蟲(chóng)質(zhì)量-飼前幼蟲(chóng)質(zhì)量)；I為幼蟲(chóng)的取食量(即I=飼前食物質(zhì)量-飼后食物質(zhì)量)；F為糞便質(zhì)量；B為試驗(yàn)期間幼蟲(chóng)的平均體質(zhì)量，B=(飼前幼蟲(chóng)質(zhì)量+飼后幼蟲(chóng)質(zhì)量)/2；T為試驗(yàn)天數(shù)。

用Excel和SAS 9.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)消化道可分離培養(yǎng)的細(xì)菌種類(lèi)

利用3種培養(yǎng)基，從杜仲夢(mèng)尼夜蛾腸道中分離到10種不同形態(tài)的菌落，提取它們的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，得到其16S rRNA基因序列。將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)(表1)和構(gòu)建ML系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1)，結(jié)果表明，它們屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)的10個(gè)屬的細(xì)菌，分別是短波單胞菌屬(Brevundimonas)、腸球菌屬(Enterococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、克呂沃爾菌屬(Kluyvera)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、莫拉菌屬(Moraxella)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)。

圖1 杜仲夢(mèng)尼夜蛾腸道可分離培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of culturable bacteria isolated from the larval guts of O. songi采用軟件 MEGA 6.0 中的最大似然法構(gòu)建而得的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，模型為K+2G，自展值為1 000； 標(biāo)尺0.05表示核苷酸位點(diǎn)的平均替代數(shù)。The phylogenetic tree was generated using the Maximum Likelihood method with 1 000 bootstraps and K+2G model on MEGA6.0 software. The scale bar represents 0.05 substitution per nucleotide position．

表1 杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的分離鑒定Tab.1 Isolation and identification of bacteria from the larval guts of O. songi

圖2 杜仲夢(mèng)尼夜蛾腸道分離細(xì)菌對(duì)纖維素(A)、果膠(B)和淀粉(C)的降解能力Fig.2 Biodegradation activity of the gut bacteria isolated from the larvae of O. songi on cellulose(A), pectin(B), and starch(C)

圖3 杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌對(duì)杜仲葉化學(xué)成分的影響Fig.3 Effects of gut bacteria isolated from larval guts of O. songi on chemical constituents of E. ulmoides leaves

2.2 腸道細(xì)菌對(duì)纖維素、果膠和淀粉的降解作用

采用DNS法測(cè)定幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌對(duì)淀粉、纖維素和果膠的降解作用，結(jié)果表明10株細(xì)菌對(duì)3種大分子物質(zhì)降解能力存在差異(圖2)。

將10株菌分別加入纖維素培養(yǎng)液后，菌株NT7吸光值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，表明該菌株可在較短時(shí)間內(nèi)分解完培養(yǎng)液中的纖維素，具有很強(qiáng)的降解能力； 8個(gè)菌株(LT1、NT2、NA3、NT4、NA5、NA6、NA8和NA9)的吸光值均呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，表明培養(yǎng)液中還原糖含量不斷上升，菌株在測(cè)定時(shí)間內(nèi)仍未完全降解纖維素，降解能力相對(duì)較弱； 菌株NT10的吸光值一直呈遞減趨勢(shì)，表明其只消耗了培養(yǎng)液中原有的單糖，但沒(méi)有降解纖維素生成新的單糖，無(wú)降解纖維素的能力(圖2A)。

將10株菌分別加入果膠培養(yǎng)液后，6個(gè)菌株(NT2、NT4、NA5、NA6、NA8和NT10)的吸光值趨勢(shì)表現(xiàn)為先上升后下降，對(duì)果膠具有較強(qiáng)的降解能力； 菌株LT1的吸光值呈現(xiàn)一直上升趨勢(shì)，對(duì)果膠的降解能力相對(duì)較弱； 菌株NA3與NT7表現(xiàn)為吸光值持續(xù)下降，對(duì)果膠無(wú)降解能力(圖2B)。

在淀粉培養(yǎng)液中加入菌液后，10株菌均有降解淀粉的能力，其中，6個(gè)菌株(LT1、NT2、NA3、NT4、NA5和NA6)的吸光值表現(xiàn)為先上升后下降，降解淀粉的能力較強(qiáng)； 4個(gè)菌株(NT7、NA8、NA9和NT10)的吸光值持續(xù)上升，降解淀粉的能力相對(duì)較弱(圖2C)。

因此，10個(gè)菌株中，菌株NT10(微桿菌)對(duì)纖維素?zé)o降解作用，菌株NA3(不動(dòng)桿菌)與菌株NT7(短波單胞菌)對(duì)果膠無(wú)降解作用，其余菌株均對(duì)纖維素、果膠和淀粉具有一定的降解能力。

2.3 杜仲夢(mèng)尼夜蛾腸道細(xì)菌對(duì)杜仲葉成分的影響

在杜仲葉培養(yǎng)液中加入腸道細(xì)菌后，進(jìn)行高效液相色譜分析。結(jié)果顯示(圖3)，在加入10個(gè)菌株的樣品圖譜中，絕大多數(shù)特征吸收峰的保留時(shí)間與對(duì)照?qǐng)D譜一致，但一些特征吸收峰上的物質(zhì)含量明顯降低，甚至一些吸收峰消失，如保留時(shí)間在3.987、6.76、13.193、19.607、22.813、30.273的吸收峰。這表明杜仲液接入細(xì)菌后，經(jīng)過(guò)微生物的降解作用，杜仲葉中的某些成分可能被細(xì)菌分解或利用，導(dǎo)致其成分發(fā)生了變化。

2.4 腸道細(xì)菌對(duì)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育及營(yíng)養(yǎng)利用的影響

2.4.1 腸道細(xì)菌對(duì)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響 抗生素處理對(duì)幼蟲(chóng)的發(fā)育和生長(zhǎng)均產(chǎn)生一定的影響(表2)?？股靥幚斫M，幼蟲(chóng)發(fā)育歷期約為22.87天，較對(duì)照組(約21.7天)延長(zhǎng)了1天； 抗生素組每齡幼蟲(chóng)的頭寬、體長(zhǎng)、體質(zhì)量均低于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)； 但后期抗生素處理組的幼蟲(chóng)化蛹率(10%)顯著低于對(duì)照組的化蛹率(86.67%)，表明抗生素處理對(duì)幼蟲(chóng)的正?；籍a(chǎn)生明顯影響。

2.4.2 腸道細(xì)菌對(duì)幼蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的影響 與對(duì)照相比，抗生素處理組幼蟲(chóng)相對(duì)生長(zhǎng)率(RGR)、食物利用率(ECI)和食物轉(zhuǎn)化率(ECD)普遍降低(表3)，尤其在1～4齡幼蟲(chóng)中降低幅度較大，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，而5～6齡幼蟲(chóng)的降低幅度較小，沒(méi)有達(dá)到顯著水平(P>0.05)。抗生素處理組幼蟲(chóng)的消耗指數(shù)(CI)和近似消耗率(AD)均稍高于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)。這表明抗生素處理后，影響了正常的腸道菌群，從而導(dǎo)致幼蟲(chóng)取食和消化能力降低，對(duì)營(yíng)養(yǎng)的利用能力減弱，需消耗更多的食物，尤其對(duì)低齡幼蟲(chóng)的影響更為顯著。

表2 抗生素處理對(duì)杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響①Tab.2 Effects of antibiotic treatment on the growth and development of O. songi larvae

表3 抗生素處理對(duì)杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的影響Tab.3 Effects of antibiotic treatment on nutritional indices of O. songi larvae

3 討論

本研究進(jìn)行了杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的分離鑒定，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步的研究。利用3種培養(yǎng)基從幼蟲(chóng)腸道分離獲得10株不同形態(tài)的細(xì)菌，分子鑒定表明它們隸屬于變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)的10個(gè)屬細(xì)菌，其中變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群。在門(mén)水平的菌群組成與其他鱗翅目昆蟲(chóng)如舞毒蛾(Lymantriadispar)，棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)，煙草天蛾(Manducasexta)和斜紋夜蛾(Spodopteralittoralis)的研究結(jié)果比較相似(Brodericketal., 2004； Xiangetal., 2006； Brinkmannetal., 2008； Tangetal., 2012)。但在屬的水平上，筆者從杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)腸道獲得10株不同屬的細(xì)菌，包括短波單胞菌、腸球菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌、克呂沃爾菌屬、不動(dòng)桿菌屬、莫拉菌屬、土壤桿菌屬、微桿菌屬和節(jié)桿菌屬，這與其他鱗翅目昆蟲(chóng)可培養(yǎng)腸道菌的組成存在明顯差異，如家蠶(Bombyxmori)腸道可培養(yǎng)菌群主要由嗜糖假單胞菌屬(Pelomonas)、羅爾斯通菌屬(Ralstonia)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和不動(dòng)桿菌屬組成(Liangetal., 2014)； 小菜蛾(Plutellaxylostella)腸道可培養(yǎng)細(xì)菌主要有沙雷氏菌屬(Serratia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)以及類(lèi)香味菌屬(Myroides)(夏曉峰等， 2013)； 棉鈴蟲(chóng)腸道中分離到鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)、不動(dòng)桿菌和擬桿菌屬(Bacteroides)的細(xì)菌(Priyaetal., 2012)。這些差異應(yīng)該與這些鱗翅目昆蟲(chóng)取食不同的寄主植物密切相關(guān)，但杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)腸道更為豐富的菌群是否與其能消化利用含膠的杜仲葉相適應(yīng)還有待于進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

淀粉是植物中主要的能量?jī)?chǔ)備物質(zhì)，纖維素和果膠是植物細(xì)胞壁的主要成分(賀學(xué)禮, 2011)。植食性昆蟲(chóng)腸道內(nèi)定殖的細(xì)菌可以將這些大分子物質(zhì)分解成小分子單糖供寄主吸收和利用(Dillonetal., 2004； Anandetal., 2010)。透明圈法通常用于研究細(xì)菌對(duì)生物大分子的降解作用，Anand 等(2010)利用該方法發(fā)現(xiàn)家蠶腸道中的假單胞菌具有很強(qiáng)的降解果膠的能力，Dantur 等(2015)研究發(fā)現(xiàn)小蔗桿草螟(Diatraeasaccharalis)腸道的腸球菌對(duì)纖維素有降解作用，鄭亞強(qiáng)等(2017)從馬鈴薯塊莖蛾(Phthorimaeaoperculella)腸道中篩選出可以降解淀粉的鞘氨醇桿菌和節(jié)桿菌。這種方法雖然可以簡(jiǎn)單快速的篩選出降解大分子的菌株，但缺點(diǎn)是有些微生物具有降解色素的能力，它們?cè)谂囵B(yǎng)過(guò)程中會(huì)形成明顯的透明圈，與具有降解能力的菌株不易區(qū)分，出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)(居乃琥， 2011)。DNS法的原理是利用二硝基水楊酸(DNS)在堿性條件下與還原糖發(fā)生反應(yīng)生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該產(chǎn)物在煮沸條件下顯棕紅色，且顏色深淺與還原糖含量成比例關(guān)系，然后用比色法測(cè)定還原糖含量，因其簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，對(duì)還原糖的種類(lèi)沒(méi)有選擇性，適用于多糖(如纖維素、果膠和淀粉等)水解產(chǎn)生多種還原糖體系的檢測(cè)(白玲等， 2004)。本研究采用DNS法，結(jié)合樣品0～72 h吸光值(代表還原糖的濃度)的變化趨勢(shì)來(lái)揭示腸道菌株對(duì)3種大分子的降解能力，吸光值結(jié)果表現(xiàn)3種變化趨勢(shì)： 1)吸光值持續(xù)下降(還原糖濃度降低)，表明溶液中沒(méi)有還原糖生成，只有還原糖的消耗，菌株對(duì)大分子無(wú)降解能力； 2)吸光值持續(xù)上升，表明菌株能夠?qū)⑷芤褐械亩嗵欠纸鉃檫€原糖，導(dǎo)致還原糖濃度增加，但液體中的多糖未被降解完，表明菌株對(duì)大分子有一定的降解能力； 3)吸光值先上升后又下降，表明菌株在短時(shí)間內(nèi)分解完多糖，導(dǎo)致還原糖濃度上升，然后又開(kāi)始利用消耗單糖，導(dǎo)致還原糖濃度下降，表明菌株具有較強(qiáng)的降解能力。因此，可以初步推斷菌株NT10(微桿菌)對(duì)纖維素?zé)o降解作用，菌株NA3(不動(dòng)桿菌)與菌株NT7(短波單胞菌)對(duì)果膠無(wú)降解作用，其余菌株均對(duì)纖維素、果膠和淀粉均具有一定的降解能力。

此外，一些腸道菌能夠幫助宿主昆蟲(chóng)防御植物的有毒次生代謝物質(zhì)，在植食性昆蟲(chóng)與寄主植物的協(xié)同進(jìn)化中發(fā)揮重要作用(Engeletal.， 2013)。例如，寄主植物在遭受甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)幼蟲(chóng)取食時(shí)會(huì)釋放N-?；被幔粌H影響幼蟲(chóng)的消化功能，而且可以產(chǎn)生能夠吸引天敵的揮發(fā)性物質(zhì)，而從其幼蟲(chóng)前腸分離的一株微桿菌屬細(xì)菌可以產(chǎn)生N-?；被崴饷福瑤椭纸膺@些防御誘導(dǎo)物質(zhì)，從而影響植物防御反應(yīng)(Pingetal., 2007)。舞毒蛾幼蟲(chóng)腸道內(nèi)的不動(dòng)桿菌能夠降解歐洲山楊(Populustremuloides)分泌的酚苷類(lèi)化合物，保護(hù)宿主不受毒害(Masonetal., 2016)。毛健夜蛾(Brithyscrini)腸道內(nèi)的克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和棒狀桿菌屬(Corynebacterium)能夠降解食物中的生物堿，大戟天蛾(Hyleseuphorbiae)腸道中的類(lèi)諾卡氏菌(Nocardioides)、戈登氏菌(Gordonia)和短小桿菌(Curtobacterium)則能夠耐受植物分泌的乳膠，對(duì)昆蟲(chóng)的腸道起到保護(hù)作用 (Vilanovaetal., 2016)。杜仲葉除了富含綠原酸、京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷、蘆丁、槲皮素等多種有效成分外，還含有特征物質(zhì)杜仲膠(曾橋等， 2017)。筆者通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)了杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)腸道菌對(duì)杜仲葉化學(xué)成分的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些物質(zhì)的吸收峰降低、甚至消失，說(shuō)明腸道菌對(duì)某些物質(zhì)產(chǎn)生影響，這種影響可能是將一些大分子物質(zhì)如多糖和蛋白分解為單糖和氨基酸供自身利用，也可能是分解了杜仲葉中的有毒成分，降低對(duì)自身的毒害作用。還需通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，深入揭示腸道菌對(duì)杜仲葉片中特定化學(xué)成分的影響，尤其是否對(duì)杜仲膠具有降解作用。

在營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和消化中具有關(guān)鍵作用的腸道細(xì)菌通過(guò)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)的吸收影響宿主昆蟲(chóng)的發(fā)育和健康(Paniaguaetal., 2018)。筆者通過(guò)喂食抗生素消除杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)腸道菌群，研究結(jié)果顯示處理組幼蟲(chóng)的相對(duì)生長(zhǎng)率、食物轉(zhuǎn)化率與利用率均低于對(duì)照組，而消耗指數(shù)與近似消耗率則高于對(duì)照組。這可能是由于缺乏腸道細(xì)菌共生體，寄主昆蟲(chóng)無(wú)法將攝取的食物順利轉(zhuǎn)化為它們所需的營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致食物轉(zhuǎn)化率和利用率降低，必須靠攝入更多的食物來(lái)維持機(jī)體需要，因而導(dǎo)致消耗指數(shù)與近似消耗率升高。相似的規(guī)律也在地中海粉螟(Ephestiakuehniella)和小菜蛾腸道細(xì)菌的功能研究中發(fā)現(xiàn)(Goharrostamietal.， 2018； 沈金紅等， 2018)。但一些研究認(rèn)為利用抗生素處理昆蟲(chóng)來(lái)評(píng)價(jià)腸道微生物必須充分考慮抗生素對(duì)宿主昆蟲(chóng)的直接效應(yīng)(劉凌云等， 2015)，所以下一步需要將這些腸道菌喂食給抗生素處理后的幼蟲(chóng)，觀(guān)察是否能促進(jìn)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)食物的轉(zhuǎn)化和利用率，驗(yàn)證腸道菌的功能。

本研究?jī)H利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法進(jìn)行了腸道細(xì)菌的分離，并對(duì)獲得的菌株進(jìn)行功能的初步研究。但由于分離培養(yǎng)的方法僅能分離出約1%的腸道細(xì)菌(葉姜瑜等， 2004)，后續(xù)仍需借助高通量測(cè)序、宏基因組或微生物組等方法全面揭示其腸道細(xì)菌的組成、變化規(guī)律，深入揭示腸道微生物在該種昆蟲(chóng)與杜仲協(xié)同進(jìn)化中的代謝機(jī)制。同時(shí)，繼續(xù)開(kāi)展腸道菌的功能研究，揭示其對(duì)杜仲葉成分、杜仲膠結(jié)構(gòu)的影響； 對(duì)功能明顯的菌株進(jìn)行種的鑒定和理化性質(zhì)分析； 也可通過(guò)人為的調(diào)控或改良杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌組成，或改變某種細(xì)菌在腸道內(nèi)的數(shù)量或者密度打破其腸道微生態(tài)平衡，尋找控制其種群密度和防治害蟲(chóng)的新方法。

4 結(jié)論

杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)腸道中可分離培養(yǎng)的10株細(xì)菌分別隸屬于變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)的10個(gè)屬，包括短波單胞菌屬、腸球菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、克呂沃爾菌屬、不動(dòng)桿菌屬、莫拉菌屬、土壤桿菌屬、微桿菌屬和節(jié)桿菌屬。大部分菌株對(duì)生物大分子(纖維素、果膠和淀粉)均有不同程度的降解作用，并顯著影響杜仲葉中成分的變化。飼喂抗生素消除腸道菌群可影響幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，顯著降低幼蟲(chóng)的化蛹率和低齡幼蟲(chóng)的取食和消化能力。因此，腸道細(xì)菌在杜仲夢(mèng)尼夜蛾幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、食物消化、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用等方面發(fā)揮著重要作用。