段紅梅，汪希銘，黃子欣，高 晶，王 璐

(東華大學(xué) 紡織學(xué)院，上海 201620)

近年來，慢性難愈合傷口給病患及醫(yī)療系統(tǒng)都帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[1-2]，同時(shí)也是全世界非創(chuàng)傷性肢體截肢的主要原因[3]，傷口潰瘍病變嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致死亡。目前國(guó)際上對(duì)于慢性傷口尚無準(zhǔn)確定義，根據(jù)我國(guó)醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)的一般標(biāo)準(zhǔn)，慢性傷口一般是指在4～8周內(nèi)無法恢復(fù)解剖和功能上的完整性且容易復(fù)發(fā)的傷口[4]。針對(duì)慢性傷口的難愈性，藥物緩釋體系的建立顯得尤為重要。

自從Vallet-Regi等[5]在2001年報(bào)道了將有序介孔材料MCM-41作為新的藥物傳遞系統(tǒng)以來，該領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。現(xiàn)有研究表明，介孔二氧化硅納米顆粒(MSNs)在藥物遞送系統(tǒng)中具有十分突出的優(yōu)勢(shì)，主要包括良好的生物相容性、低細(xì)胞毒性、孔徑可調(diào)、粒徑均一、高比表面積、易于修飾的表面性質(zhì)、高熱穩(wěn)定性以及化學(xué)穩(wěn)定性等[6-8]，這些特性賦予了介孔二氧化硅顆粒高效的藥物負(fù)載與釋放性能。Aghaei等[9]以介孔材料MCM-48為載體，以布洛芬作為藥物模型進(jìn)行藥物釋放試驗(yàn)，結(jié)果表明，布洛芬在15 d內(nèi)呈現(xiàn)緩慢釋放趨勢(shì)，且無任何細(xì)胞毒性。

近年來，靜電紡納米纖維在藥物釋放系統(tǒng)中的應(yīng)用日益廣泛，其纖維具有直徑細(xì)、比表面積大等結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[10]，使其作為藥物緩釋載體材料更有利于藥物的吸收與控制釋放[11-12]。此外，其小孔徑結(jié)構(gòu)能夠有效阻隔外界微生物進(jìn)入病灶部位；高孔隙率能夠保證創(chuàng)面與外界環(huán)境進(jìn)行充分的液體和氣體交換，更利于維持創(chuàng)面愈合所需的濕度與氧氣含量[13]。Luo 等[14]制備了攜帶抗腫瘤藥物的殼核結(jié)構(gòu)靜電紡纖維，并將纖維膜植入腫瘤位置。由于抗腫瘤藥物被包裹在纖維的內(nèi)部，在藥物釋放中達(dá)到了緩釋的效果，避免了藥物突釋。動(dòng)物試驗(yàn)表明，其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖起到長(zhǎng)期明顯的抑制作用，且副作用較小。

基于介孔納米顆粒和靜電紡絲纖維優(yōu)良的結(jié)構(gòu)特征和藥物控釋能力，本文將二者結(jié)合，首先采用溶膠-凝膠法[15]制備MSNs，通過改變反應(yīng)體系的pH值來探究MSNs的表面形貌與pH值的關(guān)系，從而優(yōu)化納米顆粒的結(jié)構(gòu)尺度；而后將合成的MSNs利用超聲浸漬法負(fù)載抗菌藥物鹽酸環(huán)丙沙星(Cip)[16]，探討了藥物溶液濃度對(duì)藥物包封率和負(fù)載率的影響；最后，將一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的載藥MSNs與聚己內(nèi)酯(PCL)紡絲液混合，通過靜電紡絲技術(shù)制備出Cip-MSNs/PCL復(fù)合納米纖維，分別探討了載藥MSNs和復(fù)合納米纖維膜中鹽酸環(huán)丙沙星的釋放行為，為針對(duì)慢性傷口的藥物緩釋系統(tǒng)的研究及在功能敷料中的應(yīng)用提供了參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

材料：正硅酸乙酯(TEOS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、氫氧化鈉、鹽酸環(huán)丙沙星一水合物(Cip)，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚己內(nèi)酯(PCL，數(shù)均分子量為80 000)，購(gòu)于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，購(gòu)于上海泰坦科技股份有限公司。以上試劑均為分析純。磷酸鹽緩沖液(PBS)為實(shí)驗(yàn)室自制。

儀器：集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南予華儀器有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；高壓靜電紡絲機(jī)，深圳通力微納科技有限公司;Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)賽默飛世爾公司;JEM-2100型透射電子顯微鏡(TEM)，日本電子株式會(huì)社;D/max-2550VB/PC型X射線衍射儀(SEM)，日本島津公司;QuadraSorb SI型比表面積分析儀，美國(guó)康塔儀器公司; TM-3000型掃描電子顯微鏡，日本日立儀器公司; S-4800型能量色散X射線光譜儀，日本電子株式會(huì)社。

1.2 介孔二氧化硅納米顆粒的制備

采用溶膠-凝膠法制備稱取0.5 g CTAB溶于240 mL去離子水中，在40 ℃條件下攪拌，待溶液澄清后分別加入一定量的NaOH溶液，使溶液pH值分別為11.6、11.8和12.0，隨后將溫度升高至80 ℃；30 min后加入2.5 mL TEOS，80 ℃條件下繼續(xù)攪拌2 h；將得到的白色懸濁液靜置冷卻一段時(shí)間后，在9 000 r/min條件下離心，并用去離子水和無水乙醇反復(fù)洗滌3次，將得到的白色凝膠在真空干燥箱中干燥12 h，再將干燥后的樣品置于馬弗爐中高溫煅燒，在550 ℃條件下焙燒6 h后所得到的白色固體粉末即為介孔二氧化硅納米顆粒(MSNs)。

1.3 載藥MSNs的制備

1.3.1 鹽酸環(huán)丙沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取鹽酸環(huán)丙沙星固體粉末20 mg于100 mL去離子水中，超聲分散均勻，將所得到的藥物溶液稀釋成合適的濃度梯度，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量各個(gè)濃度的Cip溶液在275 nm處的吸光度，由此得到Cip在水溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。鹽酸環(huán)丙沙星在pH=5.4的PBS緩沖液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線依照同樣的方法得到。

1.3.2 鹽酸環(huán)丙沙星的載入

精確稱取30 mg合成的MSNs于18 mL水溶液中，超聲分散一段時(shí)間后分別加入一定量的Cip，使Cip的質(zhì)量濃度分別為1、3、5、7、10、12 mg/mL，繼續(xù)超聲5 min后在避光環(huán)境中低速攪拌20 h，經(jīng)高速離心后在37 ℃條件下真空干燥24 h，即得到載藥MSNs(Cip-MSNs)。取離心后的上清液合并定容并稀釋1 000倍，分別測(cè)量其在275 nm處的吸光度，得到殘余的Cip濃度。包封率(E)及載藥量(D)的計(jì)算公式[17]分別如式(1)、(2)所示。

(1)

(2)

式中：ma為上清液中藥物的質(zhì)量，mg；mb為投入體系中藥物的質(zhì)量，mg；mdl為載藥顆粒的質(zhì)量，mg。

1.4 Cip-MSNs/PCL復(fù)合纖維膜的制備

1.4.1 紡絲液的配制

稱取一定量的載藥MSNs于DMF中，超聲分散一段時(shí)間后加入PCL及DCM，使溶液的質(zhì)量濃度為0.15 g/mL，DCM與DMF的體積比為7∶3，改變MSNs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3%、6%和9%。將配制好的溶液在室溫下攪拌12 h以獲得穩(wěn)定均勻的紡絲液。

1.4.2 靜電紡絲工藝

設(shè)置紡絲針頭到接收滾筒的距離為20 cm，紡絲電壓為16 kV，推注速度為1 mL/h，紡絲一段時(shí)間后得到一定厚度的載藥復(fù)合纖維膜(Cip-MSNs/PCL)。紡絲結(jié)束后，將制得的纖維膜放入37 ℃的真空干燥箱中干燥24 h，便于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 藥物的體外釋放

在傷口愈合的炎性階段，由于細(xì)菌感染，創(chuàng)面環(huán)境呈酸性[18-19]，因此，本文中的藥物釋放試驗(yàn)均模擬創(chuàng)面環(huán)境，在酸性條件下進(jìn)行。

1.5.1 Cip-MSNs中藥物的體外釋放

配制pH=5.4的PBS緩沖液，精確稱取20 mg Cip-MSNs放入裝有5 mL PBS緩沖液的透析袋中，再將透析袋置于150 mL PBS中，在恒溫?fù)u床中進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)條件為37 ℃和60 r/min。分別在一定時(shí)間間隔點(diǎn)取出5 mL釋放介質(zhì)，稀釋至適宜濃度后測(cè)量其在275 nm處的吸光度，每次取出后同時(shí)補(bǔ)充相同體積、溫度以及pH值的PBS緩沖液。根據(jù)式(3)計(jì)算Cip的累積釋放率。

(3)

式中：Cn為第n個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)釋放介質(zhì)中Cip的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為釋放時(shí)體系的恒定體積，mL；Ci為第i個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)釋放介質(zhì)中Cip的質(zhì)量濃度，mg/mL；Vi為每次測(cè)試時(shí)取出的介質(zhì)體積，mL；m0為投入到釋放介質(zhì)中的藥物質(zhì)量，mg。

1.5.2 Cip-MSNs/PCL中藥物的體外釋放

將干燥好的復(fù)合纖維膜裁剪成相似形狀，質(zhì)量控制為20 mg，置于離心管中，加入8 mL pH值為5.4的PBS緩沖液，放入同樣條件的恒溫?fù)u床中進(jìn)行試驗(yàn)。分別在一定時(shí)間間隔取出1 mL釋放介質(zhì)，其他操作同1.5.1節(jié)，并計(jì)算累積釋放率。

1.6 性能測(cè)試與表征

使用傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)對(duì)焙燒前后的介孔SiO2顆粒的化學(xué)組成進(jìn)行表征，采用KBr壓片法進(jìn)行測(cè)試。

使用透射電子顯微鏡(TEM)對(duì)介孔SiO2顆粒的結(jié)構(gòu)及形貌進(jìn)行直觀表征，將樣品超聲分散于乙醇介質(zhì)中，滴于銅網(wǎng)上自然干燥后測(cè)試。

使用X射線衍射儀對(duì)合成的介孔SiO2進(jìn)行小角X射線衍射(SAXD)試驗(yàn)，掃描范圍為0.7°～6.0°。

使用比表面積分析儀對(duì)介孔SiO2的比表面積和孔徑進(jìn)行分析。測(cè)試氛圍為氮?dú)猓瑴y(cè)試溫度為77 K，測(cè)試前樣品先進(jìn)行真空脫氣處理[20]。

使用掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)制備的Cip-MSNs/PCL纖維膜的微觀形貌進(jìn)行觀察，并使用Origin對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

使用能量色散X射線光譜儀(EDX)對(duì)Cip-MSNs/PCL纖維膜中的硅元素和氯元素進(jìn)行表征。

2 結(jié)果與討論

2.1 MSNs的表征分析

2.1.1 pH值對(duì)MSNs形貌的影響

在MSNs合成過程中，通過改變加入NaOH溶液的量使體系在不同pH值條件下反應(yīng)，所得產(chǎn)物的TEM照片如圖1所示?？梢钥闯觯趐H=11.6時(shí)，幾乎無法形成形貌規(guī)則的顆粒；隨著pH值的增大，MSNs的粒徑也隨之增加，且孔道結(jié)構(gòu)逐漸清晰均勻。在pH=11.8時(shí)，由TEM觀察到的納米粒子的平均粒徑為(63±9)nm；在pH=12.0時(shí)，平均粒徑為(184±31)nm。考慮到MSNs在靜電紡絲過程中的可操作性，采用粒徑較小的樣品進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同pH值條件下反應(yīng)得到的MSNs的TEM照片F(xiàn)ig.1 TEM images of MSNs obtained by reaction at different pH value

2.1.4 載藥前后MSNs的紅外光譜分析

MSNs在550 ℃焙燒前后的紅外光譜圖如圖2所示。可以看出，焙燒前后的MSNs在801和1 091 cm-1處均有明顯吸收峰，對(duì)應(yīng)的是Si—O—Si的伸縮振動(dòng)；1 634和955 cm-1處的吸收峰來自水分子和Si—OH的伸縮振動(dòng)。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，焙燒后3 000～2 800 cm-1處的尖銳吸收峰基本消失，此處對(duì)應(yīng)的是CTAB中C—H鍵的伸縮振動(dòng)帶，表明本試驗(yàn)采用的焙燒方法能基本去除模板劑分子，從而在二氧化硅納米顆粒中形成介孔孔道。

圖2 MSNs在550 ℃焙燒前后的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of MSNs before and after calcination at 550 ℃

2.1.4 載藥前后MSNs的XRD圖譜分析

MSNs的小角X射線衍射圖如圖3所示。在2θ為2.400°處出現(xiàn)衍射峰，說明此材料在一定尺度范圍內(nèi)出現(xiàn)了規(guī)則排列的結(jié)構(gòu)形態(tài)，存在一定的有序度。結(jié)合TEM測(cè)試結(jié)果分析，可證明該材料中介孔結(jié)構(gòu)的存在。

圖3 MSNs的小角X射線衍射圖Fig.3 SAXD pattern of MSNs

2.1.4 MSNs的比表面積及孔徑分布

MSNs的氮?dú)馕摳降葴鼐€及孔徑分布曲線如圖4所示。由圖4(a)可看出，所制備樣品材料的氮?dú)馕摳降葴鼐€有一個(gè)較小的回滯環(huán)，屬于Ⅳ型等溫線，符合典型的介孔物質(zhì)的吸附曲線。圖4(b)中縱坐標(biāo)dV/dD代表孔容隨孔徑的變化率，可看出，樣品材料的孔徑大小較為集中。采用BET模型計(jì)算得到的比表面積和孔容分別為821.124 m2/g和0.646 cm3/g，介孔平均孔徑為3.537 nm，適合用作載體材料。

圖4 MSNs的氮?dú)馕摳降葴鼐€和孔徑分布圖Fig.4 N2 adsorption-desorption isotherms(a) and pore size distribution of MSNs(b)

2.2 MSNs的載藥性能

2.2.1 Cip的質(zhì)量濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5示出Cip在水溶液和pH值為5.4的PBS緩沖液中的質(zhì)量濃度(C)-吸光度(A)標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程分別為A=106.36C和A=103.76C，擬合度R2分別為0.999 95和0.999 99?？梢?，在這2種介質(zhì)中，鹽酸環(huán)丙沙星溶液質(zhì)量濃度與吸光度具有很好的線性相關(guān)性。

圖5 Cip在水溶液和pH=5.4的PBS緩沖液中的 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of Cip in aqueous solution(a) and in pH=5.4 PBS buffer(b)

2.2.2 最佳藥物溶液質(zhì)量濃度

藥物質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為1、3、5、7、10、12 mg/mL，分別對(duì)應(yīng)的藥物包封率及載藥量曲線如圖6所示?？梢钥闯?，在藥物溶液濃度較低時(shí)，MSNs的載藥量和包封率均隨著藥物溶液質(zhì)量濃度的增加而增加，這是由載體與介質(zhì)之間的濃度梯度決定的典型擴(kuò)散作用，但當(dāng)藥物溶液質(zhì)量濃度進(jìn)一步增加時(shí)，二者均出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是由于溶液中藥物分子質(zhì)量濃度過高而形成的二聚體甚至體積較大的多聚體，由此形成的空間位阻效應(yīng)阻礙了藥物順利進(jìn)入介孔孔道的緣故[21]。在Cip質(zhì)量濃度達(dá)到7 mg/mL時(shí)，測(cè)得載藥量為51.5%，包封率為11.4%，均達(dá)到相對(duì)較高水平。

圖6 藥物溶液質(zhì)量濃度對(duì)MSNs包封率和 載藥量的影響Fig.6 Effect of drug solution concentration on encapsulation efficiency and drug loading of MSNs

2.3 Cip-MSNs/PCL纖維膜的表征分析

2.3.1 MSNs含量對(duì)纖維膜表觀形貌的影響

在紡絲液中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、6%及9%的MSNs進(jìn)行靜電紡絲，纖維膜的纖維形貌及直徑分布如圖7所示?？梢钥闯觯w維在3種不同MSNs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的條件下均呈現(xiàn)表面光滑、平直連續(xù)的狀態(tài)。隨著MSNs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，纖維直徑呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)，分別為1.50±0.27、1.36 ± 0.23及(1.32±0.45) μm。這主要是因?yàn)镸SNs的引入破壞了PCL鏈之間的分子間相互作用和鏈纏結(jié)，降低了紡絲液的黏度，使紡絲液的電導(dǎo)率增加，射流受到較大的電場(chǎng)力作用拉伸，因此，得到的纖維直徑變小[22]。綜合考慮纖維的細(xì)度及均勻度，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的MSNs作為后續(xù)試驗(yàn)的紡絲條件。

圖7 不同MSNs質(zhì)量分?jǐn)?shù)Cip-MSNs/PCL復(fù)合 纖維膜的SEM照片F(xiàn)ig.7 SEM images of Cip-MSNs/PCL composite fiber membrane with different MSNs mass fraction

2.3.2 藥物小分子的分布

Cip-MSNs/PCL復(fù)合纖維膜的EDX圖譜如圖8所示，可直觀地表征藥物分子在纖維膜中的分布情況。以藥物Cip為例，由于藥物Cip中含有特征性F元素，因此可以根據(jù)F元素的分布狀況來觀察Cip的分布。如圖8(b)所示，F(xiàn)元素呈均勻分布，表明Cip在纖維膜中呈現(xiàn)高度分散的均勻分布。同樣從圖8(a)中可看出，MSNs在纖維膜中分布均勻。

圖8 Cip-MSNs/PCL復(fù)合纖維膜的EDX圖譜Fig.8 EDX analysis of Cip-MSNs/PCL composite fiber membrane. (a) Distribution of Si; (b)Distribution of F

2.4 藥物Cip的釋放行為與釋放機(jī)制

酸性條件下，Cip分別在MSNs和MSNs/PCL纖維膜中的釋放行為如圖9所示。由圖可知，Cip在2種藥物載體中的釋放趨勢(shì)基本一致。在最初的0.5 h內(nèi)藥物釋放速率較快，在MSNs和MSNs/PCL纖維膜中Cip的累積釋放率分別為10.72%和6.09%；12 h內(nèi)的累積釋放率分別達(dá)到55.51%和16.53%，藥物在纖維膜中的釋放率由于纖維結(jié)構(gòu)的包裹遠(yuǎn)低于MSNs中的釋放率；此后Cip在2種藥物載體中緩慢釋放，在72 h時(shí)Cip的累積釋放率分別達(dá)到69.16%和21.44%，纖維結(jié)構(gòu)中的藥物釋放率僅為MSNs中的1/3；隨著時(shí)間的推移，纖維中的Cip將繼續(xù)緩慢釋放，達(dá)到長(zhǎng)效抗菌的目的。

圖9 不同藥物載體中Cip的釋放曲線Fig.9 In vitro release profile of Cip in different drug carriers

為進(jìn)一步探索藥物Cip在2種載體中的釋放機(jī)制，采用Ritger-Peppas模型(式(4))對(duì)藥物釋放結(jié)果進(jìn)行擬合，結(jié)果如圖10所示。

(4)

式中：Mt為t時(shí)刻時(shí)釋放藥物的質(zhì)量；M∞為t無窮大時(shí)釋放藥物的質(zhì)量；k為常數(shù)，表示釋放系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和幾何特征；n為釋放指數(shù)，用以表征藥物釋放的機(jī)制。

圖10 不同載體中藥物Cip釋放動(dòng)力學(xué)模型擬合Fig.10 Fitting of kinetic model of drug Cip release in different carriers

在使用Ritger-Peppas模型進(jìn)行擬合的過程中，當(dāng)n≤0.45時(shí)，藥物釋放機(jī)制為Fick擴(kuò)散；當(dāng)n≥0.89時(shí)，藥物釋放以骨架溶蝕為主；當(dāng)0.45

3 結(jié) 論

1)采用溶膠-凝膠法制備了MSNs，并探究了反應(yīng)體系pH值對(duì)MSNs表觀形貌的影響，發(fā)現(xiàn)其粒徑大小隨pH值的增大而增大。

2)MSNs負(fù)載抗菌藥物鹽酸環(huán)丙沙星的試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)鹽酸環(huán)丙沙星的質(zhì)量濃度為7 mg/mL時(shí)，MSNs的載藥量可以達(dá)到51.5%，包封率為11.4%，表現(xiàn)出良好的載藥性能。

3)采用靜電紡絲技術(shù)將載藥MSNs紡入PCL納米纖維中，得到Cip-MSNs/PCL復(fù)合纖維膜，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)載藥MSNs質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時(shí)得到的纖維較為均勻，藥物小分子在纖維膜中呈現(xiàn)出均勻分布的特征。

4)Cip-MSNs顆粒和Cip-MSNs/PCL復(fù)合纖維膜在酸性條件下的藥物釋放試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸環(huán)丙沙星在2種載體中的釋放趨勢(shì)基本一致，在最初的0.5 h內(nèi)釋放較快，在MSNs和MSNs/PCL纖維膜中Cip的累積釋放率分別為10.72%和6.09%；12 h內(nèi)的累積釋放率分別達(dá)到55.51%和16.53%；72 h后藥物仍有緩慢釋放，但纖維結(jié)構(gòu)中的藥物釋放率遠(yuǎn)低于MSNs中藥物的釋放率。

5)使用 Ritger-Peppas模型對(duì)2種藥物釋放模型進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究，結(jié)果表明，擴(kuò)散是藥物在2種載體中釋放的主要機(jī)制。

具有緩釋性能的藥物釋放模型在慢性傷口的治療中研究非常廣泛，本文所制備的復(fù)合纖維膜藥物釋放模型有望在功能性敷料中得到應(yīng)用，后續(xù)有待更深入地研究。