黃東梅，肖海濤，張志國(guó)，白 露，秦巧平

(上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 生態(tài)技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418)

糖類(lèi)物質(zhì)不僅作為植物體內(nèi)能源物質(zhì)供植物生長(zhǎng)發(fā)育，還參與植物體內(nèi)的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[1]。SWEET是一類(lèi)新發(fā)現(xiàn)的具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該蛋白可作為糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體參與糖的運(yùn)輸[2]。SWEET蛋白有著雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，可調(diào)節(jié)葡萄糖跨膜吸收[3]，其廣泛存在于原核生物、植物、人類(lèi)及其他動(dòng)物中[4]。目前SWEET蛋白在多種作物，如水稻(Oryzasativa)[3]、葡萄(Vitisvinifera)[5]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[6]、高粱(Sorghumbicolor)[7]、大豆(Glycinemax)[8]、番茄(Solanumlycopersicum)[9]等均有相關(guān)報(bào)道。研究表明，大多數(shù)物種SWEET基因家族主要分成4個(gè)分支[10]，各分支成員之間互相作用共同促進(jìn)糖的高效運(yùn)輸和細(xì)胞生命活動(dòng)，且對(duì)植物種子萌發(fā)、胚胎發(fā)育、花蜜產(chǎn)生以及花粉發(fā)育也起著十分重要的作用[11-12]。

低溫脅迫是植物生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常會(huì)遭遇的一種災(zāi)害，它不僅影響著植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量，而且容易引起植物細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的生理變化，甚至有致使植株死亡的可能性[13]。但是也有部分植物在低溫脅迫下可以通過(guò)對(duì)自身生理和生化的相應(yīng)調(diào)整，提高對(duì)低溫的耐受力，從而達(dá)到減輕甚至消除低溫脅迫帶來(lái)的傷害[14]。 由于糖的外排影響著糖的分布變化，植物中SWEET基因的調(diào)控對(duì)生物和非生物脅迫有著多種影響[15]。研究表明，SWEET基因參與調(diào)控植物花蜜分泌[16]、花粉發(fā)育[17]、赤霉素的反應(yīng)[12]、衰老[18]、逆境脅迫[19]、種子和果實(shí)發(fā)育[20]等細(xì)胞生命活動(dòng)。SWEETs以基因家族形式存在于不同植物中，水稻中鑒定了21個(gè)成員[3]，大豆中52個(gè)[8]，擬南芥中17個(gè)[6]。Xie等[21]通過(guò)對(duì)荔枝SWEET基因家族的全基因組鑒定和表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)LcSWEET2a/3b參與了早期種子發(fā)育。馬鈴薯StSWEET2a在糖脅迫后顯著上調(diào)[22]，在高溫脅迫下水稻葉片中的OsSWEET2a表達(dá)量有著明顯的變化[23]，枇杷EjSWEET2a-1在8小時(shí)鹽處理后表達(dá)量上調(diào)顯著[24]，以上均表明SWEET2a基因參與了非生物脅迫響應(yīng)。因此，研究SWEET2a基因應(yīng)對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)有著重要的意義。

萱草是深受大眾喜愛(ài)的花卉之一，‘阿斯隆’是萱草中抗寒性較好的品種，有著較高的利用價(jià)值。然而，目前尚未有萱草SWEET基因及其表達(dá)調(diào)控的有關(guān)報(bào)道。本研究采用同源克隆的方法從萱草‘阿斯隆’葉片中克隆出SWEET2a基因，利用生物信息學(xué)分析該基因的序列特征，同時(shí)研究其在低溫脅迫處理下的表達(dá)情況，旨在為萱草SWEET基因的研究與應(yīng)用提供一定的參考價(jià)值，同時(shí)為萱草SWEET基因參與低溫脅迫反應(yīng)的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

萱草‘阿斯隆’(Hemerocallisfulva)植株栽植于上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)植物園。將萱草栽植于富含腐殖質(zhì)的濕潤(rùn)土壤中，置于陽(yáng)光充足、通風(fēng)良好的地方培養(yǎng)。5～7天左右澆水一次，正常施肥，根據(jù)具體情況進(jìn)行相應(yīng)的除草、換盆換土等養(yǎng)護(hù)管理。采集萱草‘阿斯隆’長(zhǎng)勢(shì)良好且一致的葉片，用蒸餾水洗凈晾干，液氮速凍并于-80 ℃下儲(chǔ)存用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

使用改良的CTAB法[25]提取萱草葉片RNA，采用超微量分光光度法和凝膠電泳法檢測(cè)RNA的濃度、純度和完整性，-80 ℃保存?zhèn)溆?。檢測(cè)合格的RNA采用M-MuLV 第一鏈 cDNA 合成試劑盒進(jìn)行第一鏈cDNA的合成(上海生工)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因克隆

以萱草‘阿斯隆’葉片的cDNA為模板，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果篩選到的SWEET2a基因序列在兩端設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表1)，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的片段并克隆到pUCm-T Vector，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證得到全長(zhǎng)cDNA序列。實(shí)驗(yàn)所需引物序列見(jiàn)表1，引物及測(cè)序委托生工生物工程(上海)有限公司完成。

表1 實(shí)驗(yàn)所需引物序列Tab.1 Sequence of primers used in this experiment

1.4 基因的生物信息學(xué)分析

利用ExPASY(https://web.expasy.org/translate/)網(wǎng)站對(duì)SWEET2a核苷酸序列進(jìn)行翻譯，用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam)網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析，用Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)網(wǎng)站進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析采用TMHMM在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行。以HfSWEET2a蛋白序列在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)網(wǎng)站搜索同源蛋白序列，下載ONK69846.1，蘆筍asparagus；XP_008775459.1，海棗date；XP_020701878.1，鐵皮石斛dendrobe；THU64444.1，野蕉banana；XP_026394894.1，罌粟opium；OVA00198.1，博落回macleaya；XP_004968893.1，小米millet；XP_021313692.1高粱sorghum；NP_001146103.1，玉米maize；OAY69557.1，菠蘿pineapple；XP_020595974.1，蝴蝶蘭orchid；MQL94069.1，芋頭taro；RWR97356.1，沉水樟cinnamomun；XP_031490470.1，藍(lán)星睡蓮lotus；XP_012848541.1，猴面花guttata；XP_024020545.1，川桑mulberry；XP_011623118.1，無(wú)油樟amborella；TXG47757.1，漾濞槭acer；XP_017234459.1，黃胡蘿卜carrot；XP_006467563.1，橙orange；XP_022715681.1，榴梿durian；QHT64202.1，荔枝Litchi；KAF3666069.1，辣椒pepper；AMQ35580.1，馬鈴薯potato；QIE48602.1，茉莉花jasmine；XP_028118815.1，茶camellia；XP_007025233.2，可可樹(shù)cacao；XP_020553914.1，胡麻flax等28種SWEET2a蛋白序列進(jìn)行后續(xù)分析。利用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)和jalview2.10.2軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，再用MEGA7.0軟件輸出基于neighhor-joining法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，bootstrap值設(shè)置為500次重復(fù)。用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)進(jìn)行motif比對(duì)，再用NCBI的CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域查詢。

1.5 低溫處理及基因定量表達(dá)分析

為進(jìn)一步了解基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)，選長(zhǎng)勢(shì)一致的萱草幼苗移入低溫人工氣候箱中，分別置于15 ℃、10 ℃、5 ℃、0 ℃下處理，24 h后進(jìn)行取樣，取樣部位為完全展開(kāi)的功能葉片，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。利用Primer5(https://sg.idtdna.com/pages/tools/primerquest)網(wǎng)站，根據(jù)HfSWEET2a基因cDNA序列設(shè)計(jì)定量表達(dá)分析所用引物HfSWEET2a_F2/HfSWEET2a_R2，內(nèi)參為UBQ(見(jiàn)表1)。提取葉片RNA、反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，進(jìn)行qPCR，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)40次；融解曲線采集程序?yàn)?5 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差，再用Excel和SPSS22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 萱草SWEET2a基因的克隆及序列分析

以萱草‘阿斯隆’葉片的cDNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)克隆得到長(zhǎng)度為 1 045 bp的核苷酸序列，命名為HfSWEET2a，該基因已經(jīng)提交GenBank，登錄號(hào)為MT379659。序列分析顯示，HfSWEET2a含有690 bp的完整開(kāi)放式閱讀框，編碼229個(gè)氨基酸(圖1)。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析表明，HfSWEET2a編碼的蛋白分子量25.531 kDa，等電點(diǎn)9.16，定位在細(xì)胞膜。蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析顯示，HfSWEET2a含有典型的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其位置分別為：10-32，45-67，71-93，105-127，137-159，166-188，193-215(見(jiàn)圖2)。

下劃線表示PCR引物序列，黑色標(biāo)出字母分別表示起始密碼子和終止密碼子灰色部分代表兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，框出部分代表7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TM1-7)圖1 萱草SWEET2a基因的核苷酸序列及編碼氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and encoding amino acid sequence of HfSWEET2a

圖2 HfSWEET2a蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Transmembrane probabilities for HfSWEET2a

2.2 萱草HfSWEET2a基因編碼蛋白與其他植物進(jìn)化關(guān)系分析

BLASTX比對(duì)結(jié)果表明，HfSWEET2a的蛋白序列與蘆筍、菠蘿、野蕉等SWEET2a蛋白序列相似性較高，分別為75.58%、74.6%、73.09%。將HfSWEET2a蛋白與蘆筍ONK69846.1等10條蛋白質(zhì)序列進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示HfSWEET2a與這些蛋白的保守結(jié)構(gòu)域高度相似。motif比對(duì)結(jié)果顯示，它們都有3個(gè)相同的motif，且均為PQ-loop家族(見(jiàn)圖3中的PQ-loop 1、PQ-loop 2和PQ-loop 3)。

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示單子葉和雙子葉SWEET2a蛋白分別聚為兩類(lèi)，HfSWEET2a與蘆筍的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系最近，聚在同一分支，其次為菠蘿、野蕉和海棗，與雙子葉植物荔枝、胡麻以及茉莉花等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(見(jiàn)圖4)。

圖3 萱草HfSWEET2a編碼蛋白與其他10種植物SWEET2a蛋白的motif比對(duì)Fig.3 The motif comparison of HfSWEET2a and SWEET2a proteins from other 10 plants

圖4 萱草HfSWEET2a與其他28種植物SWEET2a蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 The phylogenetic analysis HfSWEET2a and SWEET2a proteins from other 28 plants

2.3 低溫對(duì)萱草HfSWEET2a基因表達(dá)的影響

基因定量表達(dá)分析顯示，在不同溫度處理下，HfSWEET2a的表達(dá)呈現(xiàn)出不同程度的變化。HfSWEET2a基因在0 ℃下表達(dá)量最高，0 ℃相對(duì)表達(dá)量是15 ℃下的3.3倍、10 ℃下的1.7倍、5 ℃下的3.7倍(見(jiàn)圖5)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，5 ℃和15 ℃下的HfSWEET2a基因表達(dá)差異不顯著，其他溫度下的基因表達(dá)均達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)。

柱形表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，相同字母表示差異不顯著圖5 不同溫度處理后HfSWEET2a基因的表達(dá)變化Fig.5 The expression of HfSWEET2a under different temperature

3 討論

糖是植物光合作用的主要產(chǎn)物，也是植物體內(nèi)的主要能源物質(zhì)[1]。SWEET蛋白廣泛存在于各種植物中，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)。目前已有大豆[8]、擬南芥[6]、小麥(Triticumaestivum)[26]、陸地棉(Gossypiumhirsutum)[27]等植物上均有關(guān)于SWEET蛋白的研究報(bào)道，但萱草作為我國(guó)傳統(tǒng)花卉之一，目前未見(jiàn)有關(guān)SWEET基因的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)PCR技術(shù)從萱草‘阿斯隆’葉片中克隆出HfSWEET2a的全長(zhǎng)cDNA序列，同源序列比對(duì)結(jié)果表明，HfSWEET2a基因所編碼的蛋白質(zhì)序列與蘆筍、菠蘿以及海棗等植物SWEET蛋白質(zhì)序列同源性較高，具有高度相似的保守結(jié)構(gòu)域，且具有均為PQ-loop家族的3個(gè)相同的motif。

SWEET家族基因一般都具有典型的6～7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，菠蘿中39個(gè)SWEET蛋白中大部分包含7個(gè)ɑ-螺旋的跨膜結(jié)構(gòu)域[10]，水稻中有18條OsSWEET蛋白具有6-7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[28]，雷蒙德氏棉SWEET基因家族跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示有22個(gè)SWEET蛋白含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，7個(gè)SWEET蛋白含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[29]。這些跨膜結(jié)構(gòu)域使其具有保守的跨膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能以及介導(dǎo)植物對(duì)疾病的感病功能[30]，本研究分離到的HfSWEET2a與其他植物SWEET蛋白相似，具有7個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域，故HfSWEET2a基因?qū)儆赟WEET基因家族，可能參與糖的跨膜運(yùn)輸。

低溫逆境脅迫是植物中常見(jiàn)的一種非生物脅迫，在低溫逆境脅迫下，會(huì)有很多結(jié)構(gòu)及生理生化方面的變化，其中可溶性糖含量變化是重要指標(biāo)之一[31]?？扇苄蕴鞘侵参镌诘蜏啬婢诚碌暮粑饔玫孜铮瑢?duì)保護(hù)物質(zhì)起滲透作用，可增強(qiáng)植物的耐寒性[32-33]。當(dāng)遭遇低溫脅迫環(huán)境時(shí)，為減少逆境脅迫帶來(lái)的傷害，植物體內(nèi)糖類(lèi)含量會(huì)有明顯的增長(zhǎng)[34-35]。SWEET蛋白作為糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體參與糖的運(yùn)輸、分配和貯藏，被運(yùn)輸?shù)街参矬w內(nèi)不同組織、細(xì)胞器中，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要生理過(guò)程[36]，不僅可以響應(yīng)生物脅迫，而且也是非生物脅迫響應(yīng)的重要蛋白，SWEETs可以通過(guò)調(diào)控糖的運(yùn)輸和分配來(lái)參與非生物脅迫的響應(yīng)[37]。

許多植物基因低溫響應(yīng)的順式元件LTR位于SWEET基因的啟動(dòng)子區(qū)域[38]，SWEET蛋白的中斷對(duì)擬南芥的耐寒性有較大的負(fù)面影響，耐寒力遠(yuǎn)不如正常植株[39]，而AtSWEET16過(guò)量表達(dá)植物卻比平常表現(xiàn)出更好的抗凍性[40]。CsSWEET16也被證明在改善擬南芥的耐寒性方面了發(fā)揮了重要作用[19]。在本研究中，萱草葉片在不同低溫情況處理，HfSWEET2a基因表達(dá)發(fā)生了不同程度的變化，這與茶樹(shù)、番茄、甘藍(lán)等研究中SWEET基因的表達(dá)較為一致。茶樹(shù)在冷訓(xùn)化過(guò)程中，不同SWEET基因的表達(dá)量有著不同的變化，CsSWEET2、CsSWEET3和CsSWEET16的表達(dá)受到了廣泛的抑制，而CsSWEET17和CsSWEET1的表達(dá)量卻有著顯著地提高[41]。番茄中9種SWEET基因在低溫處理下葉片中的表達(dá)量上調(diào)了好幾倍，而在根中則顯著下調(diào)[42]。甘藍(lán)中BoSWEET16a和BoSWEET17的表達(dá)在低溫脅迫后迅速下降，并在12 h至48 h保持低水平狀態(tài)[43]。本研究初步表明，HfSWEET2a基因可能參與了低溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)并發(fā)揮著重要作用，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。