陶 山，李 倩，范 妤，△，翟秉濤，史曉燕，段麗芳

（1．陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2．陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712046）

七珠膠囊由太白楤木、湖北海棠、葉下珠3味中藥組成，針對(duì)“濕熱毒邪內(nèi)侵，肝失疏泄，氣滯血瘀”的中醫(yī)理論[1]，以解毒祛濕、疏肝化瘀為治法進(jìn)行組方遣藥，主要用于治療急慢性肝炎、肝損傷、肝纖維化。太白楤木具有驅(qū)風(fēng)濕、散瘀血、止痛的功效。近年研究發(fā)現(xiàn)，太白楤木具有抗氧化、抗炎等作用，臨床多用于治療各種肝炎、肝硬化以及淋巴結(jié)腫大等癥[2-4]。湖北海棠具有養(yǎng)肝和胃、消積化滯等功效，以往研究表明，湖北海棠對(duì)急慢性肝損傷有顯著的保護(hù)作用[5-8]。葉下珠具有平肝清熱、利水解毒的功效，在治療傳染性肝炎、痢疾等病中有很好的療效[9-10]。本實(shí)驗(yàn)以太白楤木、湖北海棠、葉下珠3味藥的有效部位提取物—太白楤木總皂苷、湖北海棠總黃酮、葉下珠總多酚作為七珠膠囊原料進(jìn)行配伍，通過腹腔注射CCl4橄欖油溶液復(fù)制急性肝損傷小鼠模型，應(yīng)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選確定七珠膠囊在預(yù)防急性肝損傷中各組分配伍的最佳劑量，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡昆明種小鼠136只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，清潔級(jí)，由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（陜）2012-003。適應(yīng)性飼養(yǎng)于（25±2）℃恒溫動(dòng)物房中，正常明暗交替，自如飲食飲水。

1.2 藥物與試劑 太白楤木藥材購(gòu)于陜西眉縣藥材公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為五加科（Araliaceae）植物太白楤木（Aralia taibaiensis）的根皮；湖北海棠藥材購(gòu)自湖北神農(nóng)架藥材公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤老師鑒定為蘋果屬（Malus Mil）湖北海棠（Malus hupehensis（Pamp.）Rehd）的干燥葉；葉下珠藥材購(gòu)自陜西昊源中藥飲片有限公司，陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤老師鑒定為大戟科植物葉下珠（Phyllanthus urinaria L.）的帶根全草；CCl4（天津天士力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140228）；橄欖油（廣州花之王化工有限公司，批號(hào)：20140528）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為：20140909、20140923）；其它試劑均為分析純。

1.3 儀器 Centrifuge 5417R臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（Germany Eppendorf），HHS-4A 電熱恒溫水浴鍋（滬越實(shí)驗(yàn)儀器廠），JA2003型電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司，精度：1 mg），BIORAD Model 680酶標(biāo)儀（北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 潔凈級(jí)136只昆明種小鼠，隨機(jī)分為17組，每組8只。以七珠膠囊各組分作為星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案的考察因子，以太白楤木總皂苷、湖北海棠總黃酮、葉下珠總多酚作為因素，各因素分別在前期實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果確定的有效劑量范圍內(nèi)均勻選取3個(gè)水平[11-12]，分組情況見表2。

1.4.2 造模方法 昆明種小鼠雌雄分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后用于實(shí)驗(yàn)。各給藥組均按表1所設(shè)計(jì)劑量進(jìn)行灌胃給藥7 d，1次/d。末次給藥后2 h，將0.1%的CCl4橄欖油溶液按0.1 mL/10 g進(jìn)行腹腔注射，建立小鼠急性肝損傷模型[13]。在給藥及建立急性肝損傷模型過程中，各組小鼠飲食、活動(dòng)佳，均未見不良反應(yīng)，無死亡。

1.4.3 取材 末次給藥后禁食不禁水，16 h后摘眼球取血，3 000×g離心10 min分離血清，放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 血清生化指標(biāo)ALT、AST的測(cè)定 微板法檢測(cè)小鼠血清AST、ALT含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選最佳配伍比例 根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理[14-15]，在單因素基礎(chǔ)上，選取太白楤木總皂苷（X1）、湖北海棠總黃酮（X2）、葉下珠總多酚（X3）為考察因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，用代碼值-1、0、1來表示 。因素水平見表1，實(shí)驗(yàn)安排和結(jié)果見表2。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素與水平

表2 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表

2.2 模型擬合 用ANOVA分析效應(yīng)面的回歸參數(shù)。利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到七珠膠囊不同配伍組血清中AST、ALT指標(biāo)對(duì)太白楤木/A、湖北海棠/B、葉下珠/C二項(xiàng)多次回歸模型方程：綜合評(píng)分Y=0.33-0.059A-0.069B+0.074C+0.17AB-0.10AC+0.057BC-0.13A2+0.091B2-8.877E-003C2，式中評(píng)分代表肝損傷小鼠血清含AST、ALT酶的活力，A、B、C分別代表太白楤木總皂苷，湖北海棠總黃酮，葉下珠總多酚3種組分的含量。該方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.835 0，整體模型達(dá)到顯著水平（P=0.042 3），能夠反映血清酶活力與3味提取物給藥量的關(guān)系。由表3可知，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定區(qū)域范圍內(nèi)，整體模型達(dá)到顯著水平（P=0.042 3），表明太白楤木總皂苷、湖北海棠總黃酮對(duì)酶的活力有明顯影響，二次項(xiàng)中A、B的偏回歸系數(shù)達(dá)顯著水平，其他各項(xiàng)的偏回歸系數(shù)均未達(dá)到顯著水平。但是，回歸方程失擬檢驗(yàn)顯著（P=0.000 5），說明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定干擾，后續(xù)需要進(jìn)一步研究；模型擬合檢驗(yàn)極顯著，說明該方程與實(shí)際情況擬合很好，較好地反映了血清酶活力與3味提取物給藥量的關(guān)系，因此得到的回歸方程能較好的預(yù)測(cè)七珠膠囊不同配伍對(duì)急性肝損傷小鼠血清ALT、AST隨各參數(shù)的變化規(guī)律。

表3 以AST和ALT為指標(biāo)的擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

2.3 配伍優(yōu)化與預(yù)測(cè) 在因變量與另兩因素?cái)M合為三維曲面圖中，因只能表達(dá)含2個(gè)因素變量的函數(shù)，故固定3個(gè)變量中的1個(gè)為中值，以擬合的目標(biāo)函數(shù)為數(shù)學(xué)模型，繪制因變量曲面圖（圖1、2、3），最終確定七珠膠囊最佳劑量配比為：太白楤木總皂苷0.05 g/kg，湖北海棠總黃酮0.84 g/kg，葉下珠總多酚1.25 g/kg。

圖1 太白楤木總皂苷與湖北海棠總黃酮對(duì)AST、ALT的影響

圖2 太白楤木總皂苷與葉下珠總多酚對(duì)AST、ALT的影響

圖3 湖北海棠總黃酮與葉下珠總多酚對(duì)AST、ALT的影響

3 討論

肝毒劑CCl4所誘導(dǎo)的肝損傷是最經(jīng)典的化學(xué)性動(dòng)物肝損傷造模方法，因模型簡(jiǎn)單易于執(zhí)行、造模時(shí)間短等特點(diǎn)被廣泛用于研究化學(xué)性肝損傷、肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞分子機(jī)制以及保肝藥物的篩選[16-17]。ALT、AST均為肝細(xì)胞內(nèi)酶，其中，ALT是最常用的判斷肝細(xì)胞是否受損的敏感性指標(biāo)，AST水平高低則代表著肝細(xì)胞損傷的程度。正常情況下，血清中ALT、AST的含量較少，當(dāng)肝損傷發(fā)生時(shí)，大量的ALT、AST從肝細(xì)胞進(jìn)入血液，使血液中含量顯著升高[18]。目前，血清ALT、AST是檢測(cè)肝損傷的特異性標(biāo)志，也是判斷肝細(xì)胞損傷程度最為敏感的指標(biāo)[19]。

七珠膠囊原制劑為湯劑，是由太白楤木、湖北海棠、葉下珠3味藥組成，可有效治療急慢性肝炎、肝纖維化，但攜帶不便，課題組前期研究中將其改為膠囊劑[20]。太白楤木總皂苷為太白楤木的主要活性成分，來源于其根皮。研究發(fā)現(xiàn)太白楤木總皂苷對(duì)于腦、心臟、肝臟都有保護(hù)作用[2，4]。湖北海棠總黃酮是從湖北海棠葉中提取的黃酮類成分，對(duì)于急慢性肝損傷治療作用顯著。研究發(fā)現(xiàn)湖北海棠葉總黃酮可減輕CCl4及酒精所致的大鼠肝臟損傷程度，以及抑制血吸蟲所致的肝纖維化[6-7]。葉下珠總多酚具有較高的抗氧化活性，可降低肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，有效保護(hù)肝功能，在治療免疫性肝損傷中作用顯著[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各給藥組小鼠在以不同劑量組合灌胃后，血清中ALT、AST與模型組比較均有不同程度降低，表明七珠膠囊各成分配伍給藥均能有效抑制肝損傷，修復(fù)受損肝組織。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法以實(shí)驗(yàn)所考察的自變量對(duì)效應(yīng)的作用為依據(jù)，選取最佳指數(shù)并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化[21]。即通過建立數(shù)學(xué)模型描繪三維效應(yīng)面，讀取效應(yīng)面較優(yōu)區(qū)域的較佳配伍條件范圍，繼而回推出自變量取值范圍即最佳實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化方法[22]。本實(shí)驗(yàn)通過效應(yīng)面法，以急性肝損傷小鼠血清中ALT、AST的活性水平作為指標(biāo)，對(duì)七珠膠囊各組分配伍進(jìn)行優(yōu)化配比，得到最佳劑量配伍為：太白楤木總皂苷0.05 g/kg，湖北海棠總黃酮0.84 g/kg，葉下珠總多酚1.25 g/kg。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法精密度高、預(yù)測(cè)性好，能較為全面、精確地反映七珠膠囊在預(yù)防小鼠急性肝損傷中最佳的藥物成分配比，可為七珠膠囊的后續(xù)實(shí)驗(yàn)以及臨床應(yīng)用提供有效的科學(xué)依據(jù)。