劉衛(wèi)紅 賈麗超 張蕾 康群甫 周明學(xué)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是目前占中國城鄉(xiāng)居民總死亡原因首位的心腦血管疾病最主要的病理基礎(chǔ)，是一個多因素、多階段的慢性炎癥過程，發(fā)病機制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。新近研究表明，腸道菌群衍生物脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)促進了動脈粥樣硬化的發(fā)展[1-4]。因此，研究抑制慢性炎癥損傷的藥物對AS的治療可能具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

動脈粥樣硬化的中醫(yī)病機主要為痰、瘀、虛。當歸芍藥散出自《金匱要略》，除了治療各種婦科疾病的“婦人腹中諸疾痛”外，還被廣泛應(yīng)用于內(nèi)、外、神經(jīng)、皮膚、男、五官、眼等臨床各科疾病。當歸芍藥散“血水同治”的組方特點，與動脈粥樣硬化的病機特點相一致。有研究表明，當歸芍藥散具有改善脂代謝紊亂的作用[5-8]，本課題組前期研究[9-10]已證實當歸芍藥散可以顯著降低代謝性炎性小鼠血脂和炎性因子水平。

因此，本研究用LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞建立細胞炎癥模型，觀察當歸芍藥散含藥血清對炎癥因子及信號通路的影響，明確當歸芍藥散的抗炎作用并闡明其內(nèi)在機制。在中醫(yī)異病同治理論指導(dǎo)下，擴大經(jīng)典名方的應(yīng)用范圍，為其防治動脈粥樣硬化的臨床應(yīng)用提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞株

小鼠巨噬細胞RAW 264.7購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心。

1.2 藥物與試劑

當歸芍藥散組成：澤瀉80 g、當歸30 g、赤藥160 g、川芎30 g、茯苓40 g、白術(shù)40 g。中藥飲片由北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，制劑中心制備成散劑。

當歸芍藥散含藥血清的制備：SPF級Waster大鼠，雄性，40只，體重(200+10)g，隨機分為空白組和給藥組，每組各20只。給藥組按成人臨床等效劑量直接折算成大鼠用量，大鼠每日給藥劑量為0.44 g/kg,每天給藥兩次，連續(xù)給藥4天，第5天給藥后1～2小時(給藥前禁食不禁水12小時)，用0.6%的戊巴比妥鈉麻醉，1 mL/100 g，腹主動脈取血，室溫靜置2小時進后，3000 r/min離心10分鐘，無菌分離血清，56 ℃滅活30分鐘，-80℃保存。使用時，以DMEM不完全液稀釋為所需濃度。空白對照組每天給同等劑量的溶質(zhì)(蒸餾水)，給藥劑量及給藥時間同給藥組。

LPS(美國Sigma 公司，批號L2550)；白細胞介素-6(interleukin 6,IL-6,批號558301)、單核細胞趨化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein 1,MCP-1,批號558342)試劑盒均購自北京利文商貿(mào)有限責任公司；Cell Counting Kit-8(Dojindo Laboratories公司，批號C5531)，一抗核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB) Rabbit mAb (Cell Signaling公司，批號ab3301)；一抗過氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptor γ,PPARγ) Rabbit mAb (Cell Signaling公司，批號ab2908)；Anti-Beta Actin，Rabbit Pab(批號ab2100)、Dylight 800-goat anti-rabbit lgG(批號c2511)、Prestained Protein Ladder(批號c2300)均購自北京冠星宇科技有限公司；5X蛋白上樣緩沖液(批號p0002)、蛋白定量試劑盒(批號23227)購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；RNA試劑盒(批號N160121P)、RT-PCR試劑盒(批號P160211G)購自成都福際生物技術(shù)有限公司；DNA ladder (Solarbio公司，批號160215)。

1.3 儀器與設(shè)備

倒置熒光顯微鏡(Nikon，T1000)，電泳儀(批號Therno scien-tific Mini，Ge Tank)，轉(zhuǎn)膜儀(Therno scientific，Mini Blot Module)，酶標儀(Therno scientific MultiSkan3)，流式細胞儀BD FACSVerseTM(美國BD公司Callibur II 型)。

1.4 細胞培養(yǎng)及分組

小鼠巨噬細胞RAW 264.7用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)在5% CO2、37℃條件下傳代培養(yǎng)。用0.25%的胰酶消化RAW 264.7細胞，臺盼藍染色鑒定細胞活率≥95%，調(diào)整細胞濃度為1×109/L，每孔1 mL接種到24孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細胞生長至80%匯合狀態(tài)后，分為正常對照組、LPS誘導(dǎo)組、空白血清組、空白血清+LPS組、含藥血清組和含藥血清+LPS組。

1.5 干預(yù)方法

正常對照組：將RAW 264.7細胞用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，未施加任何處理因素，為正常對照組。LPS誘導(dǎo)組：將RAW 264.7細胞加入1 μg/mL的LPS，誘導(dǎo)24小時；空白血清組：將RAW 264.7細胞分別加入濃度為10%、20%空白血清，共同誘導(dǎo)24小時；空白血清+LPS組：將RAW 264.7細胞分別加入濃度為10%、20%的空白血清，孵育2小時，然后加入LPS(最終濃度為1 μg/mL)，進行刺激，共同誘導(dǎo)24小時；含藥血清組：將RAW 264.7細胞加入濃度為10%、20%的含藥血清，共同誘導(dǎo)24小時；含藥血清+LPS組：將RAW 264.7細胞加入濃度為10%、20%的含藥血清，孵育2小時，然后加入LPS(最終濃度為1 μg/mL)，進行刺激，共同誘導(dǎo)24小時。干預(yù)結(jié)束后，用胰酶消化，收集各組細胞進行以下實驗。

1.6 檢測指標

1.6.1 CCK-8法檢測細胞生長活力 將細胞接種于96孔板，培養(yǎng)24小時后，加入各組藥物進行誘導(dǎo)，培養(yǎng)18小時后，每孔加入CCK-8液(0.2 g/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。酶標儀檢測各孔A值(λ=570 nm)，細胞存活率(%)=處理組OD值/對照組OD值×100%。

1.6.2 流式細胞術(shù)檢測細胞因子IL-6、MCP-1水平 待各組細胞藥物干預(yù)結(jié)束后，收集細胞上清液，1000 rpm，離心5分鐘，取上清，凍存于-80℃。用反應(yīng)稀釋液將細胞因子標準品按照梯度法稀釋為12個質(zhì)量濃度。每個測試分別吸取4種捕獲微球各1 μL，成為混合捕獲微球，加入洗液0.5 mL，離心后去上清，用捕獲微球稀釋液重懸微球,室溫下孵育15分鐘。每個測試各取1 μL的每種微球與4種PE標記的檢測抗體混合。取待測細胞上清液和標準品各50 μL，加入50 μL混合捕獲微球, 室溫避光孵育1小時，加入檢測抗體50 μL，室溫避光孵育2小時，洗2次后每管加入300 μL洗液重懸微球，4小時內(nèi)上機檢測。

1.6.3 RT-PCR法檢測PPARγ、NF-κB mRNA表達 (1)樣品的制備：各組RAW 264.7細胞加入刺激物后繼續(xù)培養(yǎng)24小時。組織總RNA提取：用超純RNA提取試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581)提取組織樣本中總RNA。檢測RNA的純度和含量，分析總RNA完整性，取OD260/OD280為118-210的RNA用于反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄制備模板CDNA：將RNA模板、引物、5xRT Buffer 和RNase-free Water溶解，置于冰上備用。向反應(yīng)管中加入反應(yīng)體系20 μL，2 μL Primer mix，RNA 10 μL，65℃孵育5分鐘，冰浴2分鐘，離心。繼續(xù)向以上反應(yīng)管中加入以下試劑：1 μL HiFi-MmLV Enzyme Mix、2 μL 0.1 MDTT、4 μL 5x RT Buffer、1 μL 10m MdNTP Each，混勻，37℃孵育50分鐘，70℃保溫10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后的cDNA放置于-20℃保存。見表1。(2)目的基因的PCR擴增：擴增程序：95° 10分鐘，(95℃15秒，60℃60秒)×45個循環(huán)。Real Time反應(yīng)體系為：2 μL模板；0.4 μL上游引物(10 μM)；0.4 μL下游引物(10 μM)；10 μL 2×UltraSYBR Mixture。加入滅菌蒸餾水至20 μL。PCR產(chǎn)物分析：取5μL RNA，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)(Gel2Pro Analyzer Version 310)分析結(jié)果，以β-actin校正作相對量分析，結(jié)果以兩者之間吸光度的比值表示。

表1 各引物序列

1.6.4 Western Blot法檢測PPARγ、NF-κB蛋白表達 RAW 264.7細胞加入刺激物后繼續(xù)培養(yǎng)24小時。提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取樣品50 μg，煮沸變性后進行SDS2PAGE電泳(5%的濃縮膠和10%的分離膠)，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉37℃封閉1小時，加入PPARγ、NF-κB，4℃孵育過夜，洗膜，加HRP標記的相應(yīng)二抗37℃孵育1小時，ECL法顯影,分析條帶灰度值，以目的條帶與β-actin條帶的灰度比值來表示蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測LPS和不同濃度當歸芍藥散含藥血清對RAW 264.7細胞生長活力的影響

其他各組的RAW 264.7細胞生長活力與正常對照組比較，均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)?？梢? μg/mL的LPS和10%、20%的當歸芍藥散、10%、20%的空白血清均未對細胞生長活力造成影響。結(jié)果見表2。

表2 CCK-8法檢測LPS和不同濃度當歸芍藥散含藥血清對各組細胞生長活力的影響

2.2 當歸芍藥散含藥血清對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細胞細胞因子的影響

與正常對照組相比，LPS誘導(dǎo)組細胞上清中IL-6和MCP-1水平均明顯升高(P<0.05)。與10%空白血清+LPS組比較，10%當歸芍藥散含藥血清+LPS組中IL-6和MCP-1水平明顯降低(P<0.05)；與20%空白血清+LPS組比較，20%當歸芍藥散含藥血清+LPS組中IL-6和MCP-1水平明顯降低(P<0.05)?？梢?0%、20%當歸芍藥散含藥血清可降低LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細胞上清中細胞因子IL-6和MCP-1的水平。結(jié)果見表3。

表3 當歸芍藥散含藥血清對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細胞細胞因子IL-6、MCP-1表達的影響

2.3 RT-PCR法檢測當歸芍藥散含藥血清對PPARγ、NF-κB mRNA表達的影響

與正常對照組比較，LPS誘導(dǎo)組中NF-κB mRNA水平明顯升高(P<0.05)，PPARγ mRNA水平明顯降低(P<0.05)。與10%空白血清+LPS組相比，10%當歸芍藥散含藥血清+LPS組中NF-κB mRNA水平明顯降低(P<0.05)，PPARγ mRNA水平明顯提高(P<0.05)。結(jié)果見表4。

表4 當歸芍藥散含藥血清抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細胞NF-κB、PPARγ mRNA表達情況

2.4 Western Blot檢測當歸芍藥散含藥血清對NF-κB、PPARγ蛋白表達的影響

與正常對照組相比，LPS誘導(dǎo)組中NF-κB蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，PPARγ蛋白水平明顯降低(P<0.05)。與10%空白血清+LPS組相比，10%當歸芍藥散含藥血清+LPS組NF-κB蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，PPARγ蛋白水平明顯提高(P<0.05)。結(jié)果見圖1、表5。

注：A：正常對照組；B：LPS誘導(dǎo)組；C：10%空白血清組；D組：10%空白血清+LPS組；E：10%含藥血清組；F：10%含藥血清+LPS組。

表5 當歸芍藥散含藥血清抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細胞NF-κB和PPARγ蛋白的表達情況

3 討論

目前，腸道菌群在心血管疾病發(fā)病中的作用備受關(guān)注。新近研究表明，腸道菌群引起的腸心軸失衡在動脈粥樣硬化的進展中起著重要作用[11]。腸道菌群失衡會產(chǎn)生許多有害物質(zhì)，包括LPS、TMAO、PAGln，并減少短鏈脂肪酸，尤其是丁酸的產(chǎn)生[12-13]。另外，菌群構(gòu)成比例的失調(diào)可以導(dǎo)致腸道粘膜屏障功能受到破壞，增加腸道上皮的通透性，從而使脂多糖由腸道入血增多，產(chǎn)生“代謝性LPS血癥”，并誘發(fā)全身性炎癥[14]。

LPS被細胞表面的Toll樣模式識別受體識別，通過胞內(nèi)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑導(dǎo)致免疫炎癥反應(yīng)，最終促進AS發(fā)生[15]。當機體受到LPS刺激時，能夠激活巨噬細胞合成和釋放多種與炎癥相關(guān)的細胞因子，包括IL-6和MCP-1等，這些細胞因子能夠進一步激活體內(nèi)的內(nèi)皮細胞等效應(yīng)細胞釋放氧自由基、前列腺素、白三烯等炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致過度炎癥的發(fā)生[16]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS能夠增加MCP-1的表達,參與單核細胞聚集并啟動炎癥反應(yīng)。促炎因子IL-6表達上調(diào)，擴大了AS炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致了斑塊組織損傷。

NF-κB是炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的樞紐，也是啟動動脈粥樣硬化的一個關(guān)鍵信號通路[17]，可以被TNF-α、LPS等刺激活化，是調(diào)控炎癥和免疫反應(yīng)分子機制中重要的抗炎途徑。NF-κB在多數(shù)細胞以失活的形式存在于細胞質(zhì)，當細胞受到刺激(感染、氧化和抗原等)，NF-κB的抑制蛋白IKB磷酸化，相應(yīng)的蛋白酶體降解，使NF-κB激活，進入細胞核，與靶基因結(jié)合，后者可產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)(如IL-1β和TNF-α)，引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進而可以誘導(dǎo)AS的發(fā)生[18]。

PPARγ是巨噬細胞內(nèi)的核受體，對脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)均有調(diào)節(jié)作用。PPARγ在動脈粥樣硬化過程中可抑制巨噬細胞炎癥因子的釋放并能促進膽固醇外流，是一個保護性基因。同時，PPARγ可抑制單核細胞/巨噬細胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性，減少TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達水平，從而調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)[19]。

動脈粥樣硬化的中醫(yī)病機主要為痰、瘀、虛。當歸芍藥散出自《金匱要略》，由赤芍、澤瀉、當歸、茯苓、白術(shù)、川芎6味中藥組成，方中以赤芍為君藥，活血利水止痛，當歸、川芎溫通血脈，養(yǎng)血祛瘀，茯苓、白術(shù)、澤瀉健脾利水，是活血養(yǎng)血、利水化痰的代表方劑。除了治療多種各種婦科疾病外，還被廣泛應(yīng)用于臨床各科疾病。當歸芍藥散“血水同治”的組方特點，與動脈粥樣硬化的病機特點相一致。課題組前期從方證相應(yīng)的角度反證了高脂血癥及動脈粥樣硬化病理過程以痰瘀互結(jié)為主要病機[20]。在中醫(yī)異病同治理論指導(dǎo)下，深入研究當歸芍藥散治療動脈粥樣硬化的作用及其機制，將為其臨床應(yīng)用提供可靠的實驗依據(jù)。

課題組前期的在體實驗已經(jīng)證實當歸芍藥散可顯著降低代謝性炎癥小鼠血脂水平和炎性因子MCP-1和IL-6的濃度，其作用機制可能與降低NF-κB mRNA表達并提高PPARγ mRNA表達水平有關(guān)[9]。本研究采用體外實驗，探討當歸芍藥散含藥血清對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥的干預(yù)作用。結(jié)果表明，當歸芍藥散含藥血清可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細胞炎癥因子IL-6和MCP-1水平。進一步探討其抗炎的機制，發(fā)現(xiàn)當歸芍藥散含藥血清顯著降低了NF-κB mRNA和蛋白的表達，提高PPARγ mRNA和蛋白的表達。結(jié)果表明，當歸芍藥散含藥血清抑制炎癥反應(yīng)的作用可能與抑制NF-κB的活化，提高PPARγ表達水平有關(guān)，與動物實驗結(jié)果一致。

綜上所述，LPS可誘導(dǎo)RAW 264.7細胞分泌炎癥因子IL-6、MCP-1水平升高，可以作為體外炎癥細胞模型。本研究在前期實驗的基礎(chǔ)上，從體外實驗進一步證實當歸芍藥散對NF-κB及PPARγ信號通路有顯著的調(diào)控作用，并可降低其下游促炎因子IL-6、MCP-1的分泌水平，對代謝性炎癥有明確的治療作用，減緩了動脈粥樣硬化的病理進程。