劉衛(wèi)紅 賈麗超 張蕾 康群甫 周明學(xué)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是目前占中國城鄉(xiāng)居民總死亡原因首位的心腦血管疾病最主要的病理基礎(chǔ)，是一個多因素、多階段的慢性炎癥過程，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。新近研究表明，腸道菌群衍生物脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)促進(jìn)了動脈粥樣硬化的發(fā)展[1-4]。因此，研究抑制慢性炎癥損傷的藥物對AS的治療可能具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

動脈粥樣硬化的中醫(yī)病機(jī)主要為痰、瘀、虛。當(dāng)歸芍藥散出自《金匱要略》，除了治療各種婦科疾病的“婦人腹中諸疾痛”外，還被廣泛應(yīng)用于內(nèi)、外、神經(jīng)、皮膚、男、五官、眼等臨床各科疾病。當(dāng)歸芍藥散“血水同治”的組方特點，與動脈粥樣硬化的病機(jī)特點相一致。有研究表明，當(dāng)歸芍藥散具有改善脂代謝紊亂的作用[5-8]，本課題組前期研究[9-10]已證實當(dāng)歸芍藥散可以顯著降低代謝性炎性小鼠血脂和炎性因子水平。

因此，本研究用LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立細(xì)胞炎癥模型，觀察當(dāng)歸芍藥散含藥血清對炎癥因子及信號通路的影響，明確當(dāng)歸芍藥散的抗炎作用并闡明其內(nèi)在機(jī)制。在中醫(yī)異病同治理論指導(dǎo)下，擴(kuò)大經(jīng)典名方的應(yīng)用范圍，為其防治動脈粥樣硬化的臨床應(yīng)用提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.2 藥物與試劑

當(dāng)歸芍藥散組成：澤瀉80 g、當(dāng)歸30 g、赤藥160 g、川芎30 g、茯苓40 g、白術(shù)40 g。中藥飲片由北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，制劑中心制備成散劑。

當(dāng)歸芍藥散含藥血清的制備：SPF級Waster大鼠，雄性，40只，體重(200+10)g，隨機(jī)分為空白組和給藥組，每組各20只。給藥組按成人臨床等效劑量直接折算成大鼠用量，大鼠每日給藥劑量為0.44 g/kg,每天給藥兩次，連續(xù)給藥4天，第5天給藥后1～2小時(給藥前禁食不禁水12小時)，用0.6%的戊巴比妥鈉麻醉，1 mL/100 g，腹主動脈取血，室溫靜置2小時進(jìn)后，3000 r/min離心10分鐘，無菌分離血清，56 ℃滅活30分鐘，-80℃保存。使用時，以DMEM不完全液稀釋為所需濃度?？瞻讓φ战M每天給同等劑量的溶質(zhì)(蒸餾水)，給藥劑量及給藥時間同給藥組。

LPS(美國Sigma 公司，批號L2550)；白細(xì)胞介素-6(interleukin 6,IL-6,批號558301)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein 1,MCP-1,批號558342)試劑盒均購自北京利文商貿(mào)有限責(zé)任公司；Cell Counting Kit-8(Dojindo Laboratories公司，批號C5531)，一抗核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB) Rabbit mAb (Cell Signaling公司，批號ab3301)；一抗過氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptor γ,PPARγ) Rabbit mAb (Cell Signaling公司，批號ab2908)；Anti-Beta Actin，Rabbit Pab(批號ab2100)、Dylight 800-goat anti-rabbit lgG(批號c2511)、Prestained Protein Ladder(批號c2300)均購自北京冠星宇科技有限公司；5X蛋白上樣緩沖液(批號p0002)、蛋白定量試劑盒(批號23227)購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；RNA試劑盒(批號N160121P)、RT-PCR試劑盒(批號P160211G)購自成都福際生物技術(shù)有限公司；DNA ladder (Solarbio公司，批號160215)。

1.3 儀器與設(shè)備

倒置熒光顯微鏡(Nikon，T1000)，電泳儀(批號Therno scien-tific Mini，Ge Tank)，轉(zhuǎn)膜儀(Therno scientific，Mini Blot Module)，酶標(biāo)儀(Therno scientific MultiSkan3)，流式細(xì)胞儀BD FACSVerseTM(美國BD公司Callibur II 型)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)在5% CO2、37℃條件下傳代培養(yǎng)。用0.25%的胰酶消化RAW 264.7細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活率≥95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，每孔1 mL接種到24孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞生長至80%匯合狀態(tài)后，分為正常對照組、LPS誘導(dǎo)組、空白血清組、空白血清+LPS組、含藥血清組和含藥血清+LPS組。

1.5 干預(yù)方法

正常對照組：將RAW 264.7細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，未施加任何處理因素，為正常對照組。LPS誘導(dǎo)組：將RAW 264.7細(xì)胞加入1 μg/mL的LPS，誘導(dǎo)24小時；空白血清組：將RAW 264.7細(xì)胞分別加入濃度為10%、20%空白血清，共同誘導(dǎo)24小時；空白血清+LPS組：將RAW 264.7細(xì)胞分別加入濃度為10%、20%的空白血清，孵育2小時，然后加入LPS(最終濃度為1 μg/mL)，進(jìn)行刺激，共同誘導(dǎo)24小時；含藥血清組：將RAW 264.7細(xì)胞加入濃度為10%、20%的含藥血清，共同誘導(dǎo)24小時；含藥血清+LPS組：將RAW 264.7細(xì)胞加入濃度為10%、20%的含藥血清，孵育2小時，然后加入LPS(最終濃度為1 μg/mL)，進(jìn)行刺激，共同誘導(dǎo)24小時。干預(yù)結(jié)束后，用胰酶消化，收集各組細(xì)胞進(jìn)行以下實驗。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 CCK-8法檢測細(xì)胞生長活力 將細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24小時后，加入各組藥物進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)18小時后，每孔加入CCK-8液(0.2 g/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。酶標(biāo)儀檢測各孔A值(λ=570 nm)，細(xì)胞存活率(%)=處理組OD值/對照組OD值×100%。

1.6.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子IL-6、MCP-1水平 待各組細(xì)胞藥物干預(yù)結(jié)束后，收集細(xì)胞上清液，1000 rpm，離心5分鐘，取上清，凍存于-80℃。用反應(yīng)稀釋液將細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品按照梯度法稀釋為12個質(zhì)量濃度。每個測試分別吸取4種捕獲微球各1 μL，成為混合捕獲微球，加入洗液0.5 mL，離心后去上清，用捕獲微球稀釋液重懸微球,室溫下孵育15分鐘。每個測試各取1 μL的每種微球與4種PE標(biāo)記的檢測抗體混合。取待測細(xì)胞上清液和標(biāo)準(zhǔn)品各50 μL，加入50 μL混合捕獲微球, 室溫避光孵育1小時，加入檢測抗體50 μL，室溫避光孵育2小時，洗2次后每管加入300 μL洗液重懸微球，4小時內(nèi)上機(jī)檢測。

1.6.3 RT-PCR法檢測PPARγ、NF-κB mRNA表達(dá) (1)樣品的制備：各組RAW 264.7細(xì)胞加入刺激物后繼續(xù)培養(yǎng)24小時。組織總RNA提?。河贸僐NA提取試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581)提取組織樣本中總RNA。檢測RNA的純度和含量，分析總RNA完整性，取OD260/OD280為118-210的RNA用于反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄制備模板CDNA：將RNA模板、引物、5xRT Buffer 和RNase-free Water溶解，置于冰上備用。向反應(yīng)管中加入反應(yīng)體系20 μL，2 μL Primer mix，RNA 10 μL，65℃孵育5分鐘，冰浴2分鐘，離心。繼續(xù)向以上反應(yīng)管中加入以下試劑：1 μL HiFi-MmLV Enzyme Mix、2 μL 0.1 MDTT、4 μL 5x RT Buffer、1 μL 10m MdNTP Each，混勻，37℃孵育50分鐘，70℃保溫10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后的cDNA放置于-20℃保存。見表1。(2)目的基因的PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增程序：95° 10分鐘，(95℃15秒，60℃60秒)×45個循環(huán)。Real Time反應(yīng)體系為：2 μL模板；0.4 μL上游引物(10 μM)；0.4 μL下游引物(10 μM)；10 μL 2×UltraSYBR Mixture。加入滅菌蒸餾水至20 μL。PCR產(chǎn)物分析：取5μL RNA，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)(Gel2Pro Analyzer Version 310)分析結(jié)果，以β-actin校正作相對量分析，結(jié)果以兩者之間吸光度的比值表示。

表1 各引物序列

1.6.4 Western Blot法檢測PPARγ、NF-κB蛋白表達(dá) RAW 264.7細(xì)胞加入刺激物后繼續(xù)培養(yǎng)24小時。提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取樣品50 μg，煮沸變性后進(jìn)行SDS2PAGE電泳(5%的濃縮膠和10%的分離膠)，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉37℃封閉1小時，加入PPARγ、NF-κB，4℃孵育過夜，洗膜，加HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗37℃孵育1小時，ECL法顯影,分析條帶灰度值，以目的條帶與β-actin條帶的灰度比值來表示蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測LPS和不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清對RAW 264.7細(xì)胞生長活力的影響

其他各組的RAW 264.7細(xì)胞生長活力與正常對照組比較，均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)?？梢? μg/mL的LPS和10%、20%的當(dāng)歸芍藥散、10%、20%的空白血清均未對細(xì)胞生長活力造成影響。結(jié)果見表2。

表2 CCK-8法檢測LPS和不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清對各組細(xì)胞生長活力的影響

2.2 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞細(xì)胞因子的影響

與正常對照組相比，LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞上清中IL-6和MCP-1水平均明顯升高(P<0.05)。與10%空白血清+LPS組比較，10%當(dāng)歸芍藥散含藥血清+LPS組中IL-6和MCP-1水平明顯降低(P<0.05)；與20%空白血清+LPS組比較，20%當(dāng)歸芍藥散含藥血清+LPS組中IL-6和MCP-1水平明顯降低(P<0.05)?？梢?0%、20%當(dāng)歸芍藥散含藥血清可降低LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞上清中細(xì)胞因子IL-6和MCP-1的水平。結(jié)果見表3。

表3 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞細(xì)胞因子IL-6、MCP-1表達(dá)的影響

2.3 RT-PCR法檢測當(dāng)歸芍藥散含藥血清對PPARγ、NF-κB mRNA表達(dá)的影響

與正常對照組比較，LPS誘導(dǎo)組中NF-κB mRNA水平明顯升高(P<0.05)，PPARγ mRNA水平明顯降低(P<0.05)。與10%空白血清+LPS組相比，10%當(dāng)歸芍藥散含藥血清+LPS組中NF-κB mRNA水平明顯降低(P<0.05)，PPARγ mRNA水平明顯提高(P<0.05)。結(jié)果見表4。

表4 當(dāng)歸芍藥散含藥血清抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NF-κB、PPARγ mRNA表達(dá)情況

2.4 Western Blot檢測當(dāng)歸芍藥散含藥血清對NF-κB、PPARγ蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組相比，LPS誘導(dǎo)組中NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，PPARγ蛋白水平明顯降低(P<0.05)。與10%空白血清+LPS組相比，10%當(dāng)歸芍藥散含藥血清+LPS組NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，PPARγ蛋白水平明顯提高(P<0.05)。結(jié)果見圖1、表5。

注：A：正常對照組；B：LPS誘導(dǎo)組；C：10%空白血清組；D組：10%空白血清+LPS組；E：10%含藥血清組；F：10%含藥血清+LPS組。

表5 當(dāng)歸芍藥散含藥血清抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NF-κB和PPARγ蛋白的表達(dá)情況

3 討論

目前，腸道菌群在心血管疾病發(fā)病中的作用備受關(guān)注。新近研究表明，腸道菌群引起的腸心軸失衡在動脈粥樣硬化的進(jìn)展中起著重要作用[11]。腸道菌群失衡會產(chǎn)生許多有害物質(zhì)，包括LPS、TMAO、PAGln，并減少短鏈脂肪酸，尤其是丁酸的產(chǎn)生[12-13]。另外，菌群構(gòu)成比例的失調(diào)可以導(dǎo)致腸道粘膜屏障功能受到破壞，增加腸道上皮的通透性，從而使脂多糖由腸道入血增多，產(chǎn)生“代謝性LPS血癥”，并誘發(fā)全身性炎癥[14]。

LPS被細(xì)胞表面的Toll樣模式識別受體識別，通過胞內(nèi)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑導(dǎo)致免疫炎癥反應(yīng)，最終促進(jìn)AS發(fā)生[15]。當(dāng)機(jī)體受到LPS刺激時，能夠激活巨噬細(xì)胞合成和釋放多種與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子，包括IL-6和MCP-1等，這些細(xì)胞因子能夠進(jìn)一步激活體內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞釋放氧自由基、前列腺素、白三烯等炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致過度炎癥的發(fā)生[16]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS能夠增加MCP-1的表達(dá),參與單核細(xì)胞聚集并啟動炎癥反應(yīng)。促炎因子IL-6表達(dá)上調(diào)，擴(kuò)大了AS炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致了斑塊組織損傷。

NF-κB是炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的樞紐，也是啟動動脈粥樣硬化的一個關(guān)鍵信號通路[17]，可以被TNF-α、LPS等刺激活化，是調(diào)控炎癥和免疫反應(yīng)分子機(jī)制中重要的抗炎途徑。NF-κB在多數(shù)細(xì)胞以失活的形式存在于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞受到刺激(感染、氧化和抗原等)，NF-κB的抑制蛋白IKB磷酸化，相應(yīng)的蛋白酶體降解，使NF-κB激活，進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因結(jié)合，后者可產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)(如IL-1β和TNF-α)，引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而可以誘導(dǎo)AS的發(fā)生[18]。

PPARγ是巨噬細(xì)胞內(nèi)的核受體，對脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)均有調(diào)節(jié)作用。PPARγ在動脈粥樣硬化過程中可抑制巨噬細(xì)胞炎癥因子的釋放并能促進(jìn)膽固醇外流，是一個保護(hù)性基因。同時，PPARγ可抑制單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性，減少TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)水平，從而調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)[19]。

動脈粥樣硬化的中醫(yī)病機(jī)主要為痰、瘀、虛。當(dāng)歸芍藥散出自《金匱要略》，由赤芍、澤瀉、當(dāng)歸、茯苓、白術(shù)、川芎6味中藥組成，方中以赤芍為君藥，活血利水止痛，當(dāng)歸、川芎溫通血脈，養(yǎng)血祛瘀，茯苓、白術(shù)、澤瀉健脾利水，是活血養(yǎng)血、利水化痰的代表方劑。除了治療多種各種婦科疾病外，還被廣泛應(yīng)用于臨床各科疾病。當(dāng)歸芍藥散“血水同治”的組方特點，與動脈粥樣硬化的病機(jī)特點相一致。課題組前期從方證相應(yīng)的角度反證了高脂血癥及動脈粥樣硬化病理過程以痰瘀互結(jié)為主要病機(jī)[20]。在中醫(yī)異病同治理論指導(dǎo)下，深入研究當(dāng)歸芍藥散治療動脈粥樣硬化的作用及其機(jī)制，將為其臨床應(yīng)用提供可靠的實驗依據(jù)。

課題組前期的在體實驗已經(jīng)證實當(dāng)歸芍藥散可顯著降低代謝性炎癥小鼠血脂水平和炎性因子MCP-1和IL-6的濃度，其作用機(jī)制可能與降低NF-κB mRNA表達(dá)并提高PPARγ mRNA表達(dá)水平有關(guān)[9]。本研究采用體外實驗，探討當(dāng)歸芍藥散含藥血清對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥的干預(yù)作用。結(jié)果表明，當(dāng)歸芍藥散含藥血清可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥因子IL-6和MCP-1水平。進(jìn)一步探討其抗炎的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸芍藥散含藥血清顯著降低了NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)，提高PPARγ mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，當(dāng)歸芍藥散含藥血清抑制炎癥反應(yīng)的作用可能與抑制NF-κB的活化，提高PPARγ表達(dá)水平有關(guān)，與動物實驗結(jié)果一致。

綜上所述，LPS可誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞分泌炎癥因子IL-6、MCP-1水平升高，可以作為體外炎癥細(xì)胞模型。本研究在前期實驗的基礎(chǔ)上，從體外實驗進(jìn)一步證實當(dāng)歸芍藥散對NF-κB及PPARγ信號通路有顯著的調(diào)控作用，并可降低其下游促炎因子IL-6、MCP-1的分泌水平，對代謝性炎癥有明確的治療作用，減緩了動脈粥樣硬化的病理進(jìn)程。