楊珍 魏茂林 董曉英

線粒體是細(xì)胞中重要的能量工廠，與細(xì)胞中的各種生命活動息息相關(guān)，其功能異常經(jīng)常伴隨著各種人類疾病及衰老的發(fā)生。生殖衰老嚴(yán)重危害了女性的生殖和心理健康。卵巢是女性生殖衰老的敏感器官，卵巢中正常的卵泡數(shù)量和卵母細(xì)胞完成減數(shù)分裂是雌性維持正常生育能力的先決條件。當(dāng)卵巢中的原始卵泡消耗殆盡后，女性將會失去生育功能。女性卵巢功能因卵泡的不正常消耗出現(xiàn)卵巢儲備功能下降，逐步加重變成卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)，最終變成不可逆轉(zhuǎn)的卵巢早衰。因此，盡早發(fā)現(xiàn)POI對其進(jìn)行干預(yù)可以防止卵巢早衰的發(fā)生[1]。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能異常與卵巢衰老密切相關(guān)[2]。卵巢衰老主要表現(xiàn)為卵母細(xì)胞數(shù)量減少和質(zhì)量下降, 伴隨卵母細(xì)胞線粒體數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)改變及產(chǎn)能降低, 線粒體成為了卵巢衰老的決定因素, 改善卵母細(xì)胞質(zhì)量主要是通過改善線粒體功能和增加線粒體數(shù)量[3]。西醫(yī)的線粒體補(bǔ)充治療仍存在較大爭議，至今無法廣泛應(yīng)用于臨床[4]。而中藥在治療POI中發(fā)揮著重要的作用，從改善卵泡治療到體外受精的輔助治療中均得到了廣泛應(yīng)用。本研究選用中藥毓麟珠，通過觀察其對卵巢線粒體形態(tài)、分布并檢測其活力，探索其防治POI的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級BALB/c雌性小鼠7～8周齡40只，每只體重20～25 g，由北京維通利華技術(shù)有限公司提供，批號：SCXK 2012-0001。

1.2 實驗藥物與試劑

陽性對照藥：使用去離子水溶解戊酸雌二醇藥片(拜耳，德國)，濃度為0.009 mg/mL。

中藥毓麟珠制劑：包括當(dāng)歸12 g、熟地12 g、菟絲子12 g、人參6 g、花椒6 g、白術(shù)6 g、炒白芍6 g、杜仲6 g、茯苓6 g、鹿角霜6 g、川芎3 g、炙甘草3 g，飲片購自北京同仁堂科技股份有限公司。根據(jù)“人與動物體表面積等效劑量比例表”煎煮。確定中藥低劑量組每只小鼠按照體重每日給予中藥等效劑量0.234 g/mL，0.3 mL/只，高劑量組0.936 g/mL，0.3 mL/只，4℃冰箱保存。

造模試劑：根據(jù)小鼠透明帶3(ZP3)的330～342個氨基酸序列(NSSSSQFQIHGPR)合成透明帶，分析純度>90%(杭州中肽)，分別與弗氏完全佐劑(F5506，Sigma，美國)混勻成免疫試劑，與弗氏不完全佐劑(F5581，Sigma，美國)混合均勻制成免疫增強(qiáng)劑[5]。

1.3 動物模型建立、分組及給藥

通過陰道脫落細(xì)胞涂片篩選出性周期正常的雌性小鼠40只。隨機(jī)選擇8只小鼠作為正常組，其余32只用于造模[5]。造模完成后將32只小鼠隨機(jī)分成模型對照組、陽性對照組、低劑量組和高劑量組四組，每組8只，加上正常組8只，共5組。陰道脫落細(xì)胞涂片顯示動情周期紊亂提示造模成功，第15天開始灌胃。正常組和模型對照組給予生理鹽水0.3 mL，1次/天；陽性對照組每次0.3 mL戊酸雌二醇溶液，1次/天；低劑量和高劑量組給予中藥毓麟珠灌胃0.3 mL，1次/天，連續(xù)6周(休息1天/周)。

1.4 動物血液采集和卵巢組織收集

給藥6周結(jié)束后，腹腔注射孕馬血清促性腺激素(Solarbio，P9970)10 IU/只促排卵，48小時后用4%多聚甲醛0.1 mL/10g麻醉小鼠后心臟穿刺取血分離取上清，小鼠腹腔V形剪開剝離卵巢組織。卵巢戳破釋放卵丘-卵母復(fù)合物培養(yǎng)17小時，脫掉顆粒細(xì)胞獲得卵母細(xì)胞。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的測定 將小鼠血清的上清液取出采用氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測試劑盒(南京建成生物公司提供)，按照說明書操作檢測。

1.5.2 小鼠卵巢電鏡觀察線粒體形態(tài) 將卵巢切成1×1×1 mm3大小的組織塊放入Gluta固定液中4℃固定，電鏡樣品常規(guī)處理，純包埋劑包埋，超薄切片，厚度120 nm，4%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，電鏡拍照觀察。

1.5.3 卵母細(xì)胞線粒體熒光染色 將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到400 nmol/L Mito Tracker Green FM(Invitrogen，M7514)四孔皿中染色，沖洗，加入10 μg/mL Hoechst 33342(羅比，RY-IF010a)核染色。移入激光共聚焦皿中，滴加防熒光淬滅劑，供激光共聚焦顯微鏡觀察分析。

1.5.4 卵母細(xì)胞線粒體膜電位測量 將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到10 μg/mL JC-1(Biovision，catalog number 1130)四孔皿中染色。觀察紅色熒光激發(fā)光、發(fā)射光波長為559 nm、572 nm，綠色熒光激發(fā)光、發(fā)射光波長488 nm、520 nm，測得熒光強(qiáng)度，取紅光/綠光的比值代表膜電位(ΔΨm)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 毓麟珠對免疫性POI小鼠陰道分泌物的影響

陰道涂片觀察顯示，正常組小鼠動情周期正常，其余四組發(fā)生紊亂，表明造模成功。給藥結(jié)束后，陽性對照藥組、低劑量組、高劑量組動情周期基本恢復(fù)規(guī)律。肉眼觀察可見上述三組小鼠陰道分泌物黏稠呈拉絲狀，陽性對照組分泌物較為稀薄。鏡下觀察，正常組小鼠動情期細(xì)胞均質(zhì)，角化上皮細(xì)胞呈落葉狀堆積；模型對照組動情期細(xì)胞不均質(zhì)，有多種細(xì)胞混雜；陽性對照組、低劑量組和高劑量組細(xì)胞均質(zhì)，其中高劑量組角化上皮細(xì)胞數(shù)量最接近正常組(圖1)。

注：A：正常組；B：模型對照組；C：陽性對照組；D：低劑量組；E：高劑量組。

2.2 毓麟珠對免疫性POI小鼠血清ROS、SOD、MDA、GSH-Px表達(dá)水平的影響

氧化應(yīng)激指標(biāo)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型對照組ROS上升，GSH-Px下降(P<0.01)，MDA有上升，SOD有下降趨勢，表明POI疾病模型中氧自由基過度增加產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。與模型對照組比較，陽性對照組、低劑量組及高劑量組ROS下降(P<0.01)，MDA均有下降趨勢，SOD均有上升趨勢，陽性對照組和低劑量組GSH-Px升高(P<0.01)。與陽性對照組比較，低劑量組ROS降低(P<0.01)，高劑量組GSH-Px降低(P<0.01)。與低劑量組比較，高劑量組GSH-Px有顯著差異(P<0.01)(表1)。

表1 毓麟珠對免疫性POI小鼠血清ROS、SOD、MDA、GSH-Px表達(dá)水平比較

2.3 毓麟珠對免疫性POI小鼠卵母細(xì)胞線粒體染色和分布的影響

線粒體熒光染色圖片顯示，正常組線粒體在胞質(zhì)里分布均布，熒光強(qiáng)度均勻；模型對照組線粒體在近卵母細(xì)胞膜的地方較少，熒光強(qiáng)度較弱；陽性對照組、低劑量組、高劑量組線粒體熒光強(qiáng)度增加，與陽性對照組相比在胞質(zhì)跟膜的分布上，高劑量組效果較好，且比低劑量分布更均勻(圖2)。

圖2 免疫性POI小鼠血清線粒體熒光染色圖

2.4 毓麟珠對免疫性POI小鼠卵母細(xì)胞線粒體形態(tài)的影響

與正常組比較，電鏡觀察到模型對照組線粒體平均體積增大，比表面積減小，密度減低，數(shù)目減少，部分線粒體之間融合，且出現(xiàn)病變?nèi)缒[脹，空泡樣變及包涵體形成，有白泡樣變且有出現(xiàn)高爾基體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫大等。正常組的線粒體基本呈圓形，分布密度適中，內(nèi)嵴清晰分明。陽性對照組線粒體形態(tài)基本呈圓形，嵴少見，輪廓明顯。低劑量組出現(xiàn)不少線粒體和小泡，并有少量的脂滴，線粒體嵴不明顯，基質(zhì)密度不均勻，局部空化。高劑量組線粒體嵴明顯，基質(zhì)密度均勻，數(shù)量較多，少量線粒體局部空化(圖3)。

注：A：正常組；B：模型對照組；C：陽性對照組；D：低劑量組；E：高劑量組。

2.5 毓麟珠對免疫性POI小鼠卵母細(xì)胞線粒體膜電位的影響

與正常組比較，模型對照組膜電位顯著下降且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。與模型對照組比較，陽性對照組、低劑量組和高劑量組顯著升高且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，且高劑量組的膜電位比低劑量組高且有比陽性對照組高的趨勢，膜電位值最接近正常組(圖4、表2)。

表2 毓麟珠對免疫性POI小鼠卵母細(xì)胞線粒體膜電位的影響

3 討論

女性生殖功能直接由卵巢的壽命決定，由大約30萬個原始卵泡組成，發(fā)揮生殖細(xì)胞庫的作用[6]。盡管ROS在排卵過程中起著重要作用，但ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激對女性生殖有著不利作用，特別是對卵巢功能和一些生殖疾病。優(yōu)質(zhì)卵子的發(fā)生，生殖細(xì)胞的生長、發(fā)育和分化都需要充足的ATP水平。由核苷酸改變引起的線粒體功能障礙可能導(dǎo)致卵子發(fā)生受損或加速生殖細(xì)胞凋亡和POI。ROS可觸發(fā)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔在單個線粒體內(nèi)的誘導(dǎo)，進(jìn)一步刺激ROS形成，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放是線粒體對氧化應(yīng)激的一種反應(yīng)，導(dǎo)致ROS信號放大，大量的ROS導(dǎo)致鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，鈣離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)受損，線粒體通透性改變，ATP合成停止，線粒體膜電位不穩(wěn)定，導(dǎo)致卵母細(xì)胞老化[7]。

毓麟珠出自《景岳全書·婦人規(guī)》，由八珍丸加菟絲子、杜仲、鹿角霜、川椒等12味藥物組成。全方益氣養(yǎng)血，溫補(bǔ)脾腎，調(diào)經(jīng)種子?，F(xiàn)代臨床常將其作為補(bǔ)腎育卵助孕之方。方中主要藥物熟地、當(dāng)歸、人參。熟地補(bǔ)益精血，可通過興奮下丘腦-垂體-腎上腺軸，導(dǎo)致促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放增加，抵抗血清雌激素水平下降，減緩卵巢衰老[8]。當(dāng)歸補(bǔ)血和血，可以加速血液的生成與流通，同時還能保護(hù)和改善造血微環(huán)境[9]。人參大補(bǔ)元氣，補(bǔ)脾益肺，有改善造血機(jī)能提高機(jī)體免疫力的作用[10]。通過上述中藥藥理活性的研究表明該方具有抗氧化應(yīng)激及抗衰老的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，給藥組氧化應(yīng)激水平改善表現(xiàn)在ROS下降、GSH-Px上升，其中中藥組表現(xiàn)了更加明顯的優(yōu)勢。研究表明，排卵前卵泡調(diào)節(jié)ROS的生成是卵子發(fā)生的重要促進(jìn)因子[11]。氧限制或缺氧可刺激卵泡血管生成，對卵泡的生長發(fā)育影響重大，氧自由基可作用信號轉(zhuǎn)換器或細(xì)胞內(nèi)信使引發(fā)血管生成反應(yīng)，卵泡內(nèi)血管生成的損害可以導(dǎo)致卵泡閉鎖[12]。因此,表明中藥在降低氧自由基過度產(chǎn)生、增加抗氧化因子，緩解氧化應(yīng)激上更有優(yōu)勢。本實驗通過線粒體熒光染色圖片和電鏡顯示，毓麟珠高劑量組線粒體的熒光強(qiáng)度、分布和形態(tài)、數(shù)量都有較好的改善，膜電位水平大幅提高，說明中藥組在提升線粒體活性上有顯著作用，且高劑量組線粒體的活力水平恢復(fù)接近正常。相關(guān)研究表明，低質(zhì)量的卵母細(xì)胞線粒體膜電位降低，DNA損傷增加，形態(tài)異常，基因表達(dá)改變，這些線粒體變化產(chǎn)生了過量的活性氧[13]。由此可以推斷，毓麟珠可能通過干預(yù)免疫性POI小鼠卵母細(xì)胞線粒體的熒光強(qiáng)度、分布和形態(tài)、數(shù)量以及活力水平，改善激素水平和氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而改善卵子質(zhì)量幫助改善卵巢功能。但是對毓麟珠的有效成分及其作用靶點還需進(jìn)一步深入研究，相信從卵母細(xì)胞線粒體入手，更全面的實驗探索將會對卵巢功能下降相關(guān)疾病的治療提供更多的依據(jù)，為POI婦女實施更優(yōu)化的助孕策略提供幫助。

圖4 免疫性POI小鼠線粒體膜電位熒光圖