孟園 李平 趙超群 袁晶 李青穆 趙靜苗 劉欣

高血壓時，RAAS系統(tǒng)及交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活，高同型半胱氨酸及高血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)等狀態(tài)使血管收縮和舒張的平衡被打破，且能夠?qū)е卵軆?nèi)皮功能受損。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內(nèi)皮前體細(xì)胞，可以分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，對受損血管內(nèi)皮具有修復(fù)作用。研究表明，高血壓患者EPCs數(shù)量明顯下降[1]，且EPCs的遷移能力明顯降低[2]，從而影響了EPCs對受損內(nèi)皮的修復(fù)。內(nèi)皮功能障礙與高血壓的發(fā)生相互影響、互為因果[3]、惡性循環(huán)。因此，增加EPCs數(shù)量，改善其功能成為抗高血壓的又一途徑。眾多臨床試驗[4-6]及基礎(chǔ)實驗[7-8]皆證明雌激素對于EPCs起到保護(hù)作用，雌激素可抑制外周血EPCs衰老和凋亡，增加其數(shù)量，并增強(qiáng)其增殖、分化及遷移等生物活性。雌激素替代治療(estrogen replacement therapy，ERT)現(xiàn)應(yīng)用于心血管疾病臨床防治，但存在爭議。中藥淫羊藿具有補(bǔ)肝腎，助陽益精，祛風(fēng)濕，治陽痿，腰膝痿弱、風(fēng)濕痹痛等功用。淫羊藿具有類性激素作用，且臨床上二仙湯(仙茅、淫羊藿是其重要組成)常用于治療圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后女性高血壓，療效顯著[9-10]。淫羊藿苷為淫羊藿的主要藥用成分，除改善性功能障礙、更年期骨質(zhì)疏松、老年癡呆、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病外，還具有心血管保護(hù)方面作用，能夠抗動脈粥樣硬化[11]，抗高血壓[12]，抗心肌缺血再灌注損傷[13]等。有研究[14]報道，淫羊藿苷是一種植物類雌激素。淫羊藿苷的抗高血壓作用是否與其類雌激素作用有關(guān)，且淫羊藿苷的降血壓作用是否通過調(diào)節(jié)EPCs實現(xiàn)的。為此，本課題通過給予去勢雌性自發(fā)高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)外源性雌激素及淫羊藿苷干預(yù)，觀察淫羊藿苷對高血壓EPCs增殖及功能影響，并探索其作用機(jī)制，為淫羊藿降作用提供新角度的闡釋。為植物類雌激素應(yīng)用于心血管疾病的防治提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

9周齡清潔級去勢雌性SHR大鼠50只，體重(150±10)g。9周齡清潔級具有相同遺傳背景的正常血壓的雌性京都Wistar大鼠(Wistar Kyoto rats，WKY)10只，體重(150±10)g。以上動物均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證編號：SCXK(京)2016-0006]。普通飼料喂養(yǎng)，室溫保持在(22±2)°C，相對濕度(55±5)%，光照時間7:00～19:00。

1.2 實驗藥物

雌二醇(estradiol，E2)：戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂)，購自德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司出品，批號：200A5; 雌激素受體抑制劑：氟維斯群注射液(芙仕得)，購自國藥集團(tuán)醫(yī)藥控股北京華鴻有限公司，批號：LK774；淫羊藿苷(icariin)：98%純度標(biāo)準(zhǔn)品，南京廣潤生物制品有限公司出品，批號：GR-133-150509。

1.3 實驗儀器

大鼠尾套管法無創(chuàng)血壓計：日本Softron公司，型號：BP-2006A；酶標(biāo)儀：美國Thermo公司，型號B004；倒置熒光顯微鏡：日本Olympus公司，型號LX7。

1.4 實驗試劑

大鼠骨髓EPCs分離液試劑盒：天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，貨號：VE2012TARK(G)；大鼠外周血EPCs分離液試劑盒：天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，貨號：VE2012RATK；EPCs培養(yǎng)基：Lonza公司，EGM-2 BulletKit，貨號：CC-3162(CC-3156&CC-4176)；一氧化氮(nitric oxide,NO)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，貨號：A012-1-2；FITC標(biāo)記荊豆凝集素I(FITC-UEA-I)，Sigma公司，貨號：L9006；Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-Ac-LDL)：索萊寶公司，貨號：H7970；纖維蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)：Corning公司，貨號：356008。

1.5 實驗造模

10只WKY、50只SHR雌性大鼠給予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，繼而行無菌卵巢切除術(shù)，按1 mL/100 g ，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹位固定，于軀干下1/3，脊柱兩側(cè)各1 cm處延脊柱方向作縱形切口，長約1 cm，逐層分離，深入體腔，可見肉色卵巢團(tuán)塊，用眼科鑷輕輕將其拉出，下聯(lián)直徑約0.1 cm的肉色輸卵管，在輸卵管近卵巢端穿一絲線，結(jié)扎，減去卵巢及余線，將組織退回腹腔，縫合切口，給予切口青鏈霉素預(yù)防感染。

1.6 分組及給藥方法

術(shù)后14天后，10只WKY雌性大鼠作為空白組(WKY組)。將SHR雌性大鼠隨機(jī)分為模型組(SHR組)、雌激素組(SHR-E2組)、淫羊藿低劑量組(SHR-I組)、淫羊藿高劑量組(SHR-HI組)及淫羊藿苷低劑量組+氟維司群組(SHR-I+ICI)。由于預(yù)實驗表明淫羊藿低劑量組20 mg/kg保護(hù)效應(yīng)較淫羊藿高劑量組40 mg/kg略強(qiáng)，因此此處設(shè)置低劑量組+雌激素受體拮抗劑。每組各10只大鼠。WKY組、SHR組給予溶劑純水灌胃，SHR-E2組給予戊酸雌二醇灌胃，SHR-I組、SHR-HI組分別給予低、高劑量的淫羊藿苷灌胃，SHR-I+ICI組按每月52 mg/kg給予皮下注射氟維司群注射劑。

1.7 大鼠外周血及骨髓來源EPCs分離及培養(yǎng)

給藥8周后，各組大鼠全部給予4%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈抽取大鼠外周血5～10 mL，緩慢加于盛有EPCs分離液的離心管中，注意外周血在上，分離液在下，外周血：分離液體積1∶2，且二者須保持明顯界限，離心500 g，25分鐘。離心后，吸取中間云霧層，并用清洗液洗滌細(xì)胞兩次后，培養(yǎng)基重懸進(jìn)行計數(shù)及培養(yǎng)(具體步驟參見大鼠外周血EPCs分離液試劑盒)。

大鼠失血性死亡后，剪開皮膚，暴露并剪取后肢，置于75%酒精中浸泡15分鐘，轉(zhuǎn)至超凈臺操作。在超凈臺上剪開兩端骨骺，暴露骨髓腔并用沖洗液沖洗至骨干發(fā)白。收集沖洗液并吹打均勻后，經(jīng)細(xì)胞篩過濾，制成細(xì)胞懸液，離心450 g， 5分鐘后棄上清。用稀釋液重懸細(xì)胞，緩慢加于盛有EPCs分離液的離心管中，注意細(xì)胞懸液在上，分離液在下，細(xì)胞懸液與分離液的體積比為1∶2，且二者須保持明顯界限，離心500 g，25分鐘。離心后，吸取中間云霧層，并用清洗液洗滌細(xì)胞兩次后，培養(yǎng)基重懸進(jìn)行計數(shù)及培養(yǎng)(具體步驟參見大鼠骨髓EPCs分離液試劑盒)。

將每組4只大鼠的外周血和骨髓來源的EPCs懸液以每孔2×105的密度接種在事先包被好纖維蛋白的12孔板內(nèi)，每3天換液一次，于種植后1天、3天、6天于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并于第4天給予細(xì)胞鑒定。其余6只大鼠的外周血和骨髓來源的EPCs懸液以每孔2×104的密度接種在96孔板內(nèi)培養(yǎng)，每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)4天后進(jìn)行細(xì)胞活性及NO分泌水平測定。

1.8 指標(biāo)檢測

1.8.1 各組大鼠體重檢測 自動物飼養(yǎng)之日起每周電子稱監(jiān)測大鼠體重。

1.8.2 各組大鼠血壓及心率比較及自身用藥前后比較 每組隨機(jī)選取5只大鼠，選擇大鼠去勢后藥物干預(yù)之前，以及藥物干預(yù)8周后兩個時間點測量平均動脈壓及心率。測量方法：用日本Softron公司生產(chǎn)的動物無創(chuàng)血壓計BP-2006A，將套管套在大鼠尾部，加熱鼠籠，使大鼠在溫暖的環(huán)境中逐漸平靜，待情緒穩(wěn)定后測量大鼠靜息狀態(tài)下的血壓。

1.8.3 EPCs鑒定 提取外周血及骨髓來源的EPCs，用FITC-UEA-I與Dil-Ac-LDL對貼壁細(xì)胞進(jìn)行熒光染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.8.4 四噻唑藍(lán)(MTT)法檢測各組大鼠外周血及骨髓來源EPCs活性 將各組骨髓及外周血來源的EPCs以2×104接種在事先包被好Fn的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，4天后，避光條件下每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，37℃、5%CO2條件下孵育4小時；棄上清，每孔加入150 μL DMSO；震蕩搖勻10分鐘；用酶標(biāo)儀(測定波長490 nm)測定吸光度值。

1.8.5 NO分泌水平檢測 硝酸還原酶法檢測各組外周血及骨髓EPCs培養(yǎng)上清液中NO分泌水平，操作按南京建成試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重變化

給藥前WKY及SHR各組大鼠體重?zé)o差異(P>0.05)。給藥后，雌激素能夠明顯降低雌性SHR組大鼠體重(P<0.05)，而淫羊藿苷對大鼠體重?zé)o明顯影響(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠給藥前后體重變化比較

2.2 各組大鼠給藥前后平均動脈壓差異

給藥前，SHR組大鼠平均動脈壓與WKY組雌性大鼠比明顯升高(P<0.05)，而SHR各組間無明顯差異(P>0.05)。給藥后，WKY組及SHR組大鼠明顯升高(P<0.05)；SHR組大鼠與WKY雌性大鼠比明顯升高(P<0.05)，雌激素及淫羊藿苷能夠明顯降低SHR組大鼠平均動脈壓(P<0.05)，且淫羊藿苷的降血壓作用能夠被雌激素受體抑制劑削弱(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠給藥前后平均動脈壓變化比較

2.3 各組大鼠給藥前后心率差異

給藥8周后WKY組及SHR組大鼠心率較自身之前明顯升高(P<0.05)。給藥前，WKY及SHR各組間大鼠心率無差異(P>0.05)。給藥后，雌激素對SHR組大鼠心率無影響(P>0.05)，淫羊藿苷能夠明顯降低SHR組大鼠心率(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠給藥前后心率變化比較次/分)

2.4 各組大鼠外周血及骨髓來源EPCs培養(yǎng)及鑒定

2.4.1 EPCs形態(tài)學(xué)特征 倒置相差顯微鏡下，剛分離得到的EPCs呈圓形，培養(yǎng)1天后可見細(xì)胞貼壁，見圖1A、圖1D；細(xì)胞呈梭型，菱型或三角型。培養(yǎng)72小時后，可見細(xì)胞體積較之前增大，并且可以看見散在的呈梭形的貼壁細(xì)胞，見圖1B。培養(yǎng)6天后，細(xì)胞呈梭形或排列成索條狀，增殖較前緩慢，見圖1C。

注：A：培養(yǎng)1天(4×10)；B：培養(yǎng)3天(4×10)；C：培養(yǎng)6天(4×10)；D：培養(yǎng)1天(10×10)。

2.4.2 EPCs鑒定 貼壁細(xì)胞經(jīng)過Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙染色后，在倒置熒光顯微鏡下檢查，可見到吞噬Dil-ac-LDL的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，見圖2A；吞噬FITC-UEA-1的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，見圖2B；雙染色陽性的細(xì)胞便是分化中的EPCs，見圖2C。

注：A：吞噬Dil-ac-LDL；B：吞噬FITC-UEA-1；C：雙染。

2.5 各組大鼠外周血及骨髓來源EPCs活性差異

與WKY雌性大鼠相比，SHR組大鼠骨髓及外周血來源EPCs活性皆明顯降低(P<0.05)。雌激素及淫羊藿苷能夠明顯增加SHR組大鼠骨髓及外周血來源EPCs活性(P<0.05)，且淫羊藿苷的作用能夠被雌激素受體阻斷劑削弱(P<0.05)。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠骨髓及外周血來源EPCs活性的OD值比較

2.6 各組大鼠外周血及骨髓來源EPCs培養(yǎng)上清液中NO分泌水平

與WKY雌性大鼠相比，SHR組大鼠骨髓及外周血來源EPCs培養(yǎng)上清液中NO分泌水平皆明顯降低(P<0.05)。雌激素及淫羊藿苷能夠明顯增加SHR組大鼠骨髓及外周血來源EPCsNO分泌水平(P<0.05)，且淫羊藿苷的作用能夠被雌激素受體阻斷劑削弱(P<0.05)。結(jié)果見表5。

表5 各組大鼠骨髓及外周血來源內(nèi)皮祖細(xì)胞NO的分泌水平比較

3 討論

血管內(nèi)皮功能損傷是心血管疾病重要病理生理基礎(chǔ)和始動環(huán)節(jié)。內(nèi)皮損傷后可通過細(xì)胞自噬限制損傷擴(kuò)大，且骨髓來源的EPCs能遷移至內(nèi)皮損傷部位，合并入內(nèi)皮細(xì)胞層，分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而修復(fù)損傷。因此，EPCs的功能對于內(nèi)皮損傷修復(fù)至關(guān)重要。但研究表明，高血壓患者由于其高AngII水平及高Hcy水平， EPCs 數(shù)量明顯下降[15]，EPCs的遷移能力明顯降低[2]。本研究結(jié)果表明，與WKY大鼠相比，SHR大鼠EPCs活性及NO分泌能力明顯降低，印證上述臨床現(xiàn)象，并與其他實驗研究結(jié)果相一致[16]。

雌激素替代治療中發(fā)現(xiàn)，雌激素能夠抗高血壓[17-18]。絕經(jīng)前女性外周血中EPCs的水平明顯高于同齡男性，進(jìn)入絕經(jīng)期后，女性外周血中的EPCs水平下降，與同齡男性外周血中EPCs水平基本相同[4]，可見高血壓的性別差異與EPCs功能有關(guān)，雌激素對于EPCs的保護(hù)作用在此起了關(guān)鍵作用。應(yīng)用雌激素替代治療的患者較未用雌激素替代治療的患者外周血中EPCs數(shù)目有所增加[6]。且動物實驗表明雌激素能夠動員骨髓EPCs，增加外周血中EPCs的數(shù)目[8,19]，增強(qiáng)EPCs增殖，分化及遷移等生物活性，且這一作用是通過激活ERα，并通過下游PI3K通路來實現(xiàn)的[20-21]。雌激素能夠通過膜雌激素受體激活PI3K/Akt/eNOS信號途徑抑制EPCs的凋亡，促進(jìn)其增殖，增加NO的生成[22]。本研究證實，外源性雌激素能夠降低SHR大鼠血壓，且與其增加骨髓及外周血中EPCs活性及NO分泌能力，這一作用可能是通過膜雌激素受體實現(xiàn)的。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果相一致。

雌激素對于女性心血管的保護(hù)作用明確，心血管疾病的雌激素替代治療也是目前研究的熱點，但其不良反應(yīng)、給藥劑型、用藥時機(jī)等仍存在爭議。中醫(yī)補(bǔ)腎法中藥湯劑及眾多植物類雌激素對女性心血管疾病治療有其優(yōu)勢。淫羊藿苷作為淫羊藿的主要藥用成分，具有抗高血壓作用，且既往研究證實其能夠增加血管生成，減少氧化應(yīng)激損傷下EPCs細(xì)胞的自噬[23]，其對人外周血EPCs細(xì)胞的保護(hù)作用已被多項研究證實[24-26]，但尚無同時探索其對骨髓及外周血二者EPCs影響的研究。且關(guān)于淫羊藿苷抗高血壓的報道較少。本研究探索了淫羊藿苷的降血壓作用，研究結(jié)果證實了其有較好的降壓效果，不遜于雌激素，效果可達(dá)10～20 mmHg，為其后期單用、組方或與西藥聯(lián)合應(yīng)用于臨床降血壓治療提供了理論依據(jù)。且本研究首次探索淫羊藿苷對高血壓大鼠骨髓及外周血來源的EPCs的保護(hù)作用，證實其能夠增加EPCs的細(xì)胞活性，增加其NO分泌，且該作用可能是通過直接或間接作用于雌激素受體發(fā)揮作用的。因此，推測淫羊藿苷對高血壓EPCs的保護(hù)作用是一種類雌激素作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷能夠降低大鼠血壓、心率，該作用可能與其增加EPCs活性，增加其NO分泌能力有關(guān)，且該作用與雌激素相似，其機(jī)制可能與其激活雌激素受體下游通路有關(guān)。淫羊藿苷作為一種植物類雌激素作用溫和，臨床應(yīng)用前景廣闊，但其對心血管疾病及血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的保護(hù)作用及其機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。