于澤謀 李永超 郝洪軍 黃一寧 彭清

有研究顯示，整合應激反應與代謝性疾病和動脈粥樣硬化密切相關［1］。整合應激反應系指真核生物受到不同刺激后，觸發(fā)真核翻譯起始因子2 α（eIF2α）在絲氨酸第51 位點磷酸化而介導的細胞適應性反應［2］，但持續(xù)性整合應激反應或嚴重應激反應則可誘發(fā)細胞凋亡。研究顯示，高脂飲食可使細胞攝取過多脂質而致內質網(wǎng)發(fā)生應激反應［3］，而蛋白激酶R 樣內質網(wǎng)激酶（PERK）通過與未折疊蛋白相結合激活eIF2α，進而誘發(fā)整合應激反應。在動脈粥樣硬化形成的過程中，整合應激反應具有促進炎癥小體形成和炎性因子釋放的作用［1］，且持續(xù)存在并貫穿于粥樣硬化斑塊（以下簡稱斑塊）發(fā)生發(fā)展之全過程［4］，抑制該反應可減少泡沫細胞形成、抑制炎癥反應，從而延緩動脈粥樣硬化進展［5］。本課題組前期研究顯示，絲氨酸棕櫚酰轉移酶（SPT）抑制劑Myriocin 可以延緩動脈粥樣硬化進展，但其潛在作用機制尚未闡明［6］。本研究旨在探索Myriocin對血管整合應激反應的作用。

材料與方法

一、實驗材料

1. 實驗動物 基因背景為C57BL/6J 雄性無特定病原體（SPF）級載脂蛋白E 基因敲除（ApoE-/-）小鼠共18 只，11 周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［合格證號：SCXK（京）2016-0006］，飼養(yǎng)于北京大學第一醫(yī)院實驗動物中心，溫度18 ～22 ℃、濕度50%～60%，12 h 晝-12 h 夜循環(huán)照明，適應性喂養(yǎng)1 周后予高脂飼料（21%豬油+0.15%膽固醇，4.554 kCal/g，購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司）喂養(yǎng)。動物實驗操作過程嚴格遵循北京大學第一醫(yī)院倫理委員會制定的規(guī)章制度（決議號：J201818）。

2.試劑與儀器 （1）藥品與試劑：Myriocin 和紅細胞裂解液購自美國Sigma 公司和Beckman Coulter公司。別藻藍蛋白（APC）標記的CD115 抗體和藻紅蛋白（PE）標記的淋巴細胞抗原6 復合體（Ly?6c）抗體（均1 ∶100）由美國Ebioscience 公司提供；TRIzol試劑為美國Life Technologies 公司產品，引物序列由北京天一輝遠生物科技有限公司合成，TransScript First?Strand cDNA Synthesis SuperMix 和TransStart Top Green qPCR SuperMix 購自北京全式金生物技術有限公司；RIPA 裂解液由北京普利萊基因技術公司提供，二辛可寧酸（BCA）檢測試劑盒為美國Thermo Pierce 公司產品，ECL 發(fā)光液購自美國Millipore 公司，Ⅰ抗工作液主要包括eIF2α、肌醇依賴酶1α（IRE1α）、活化轉錄激活因子4（ATF4）、p65核因子?κB（p65 NF?κB）和磷酸化p65 NF?κB 抗體（均1 ∶1000）購自美國CST 公司，磷酸化IRE1α抗體（1 ∶1000）購自美國Thermo 公司，Caspase12 抗體（1 ∶1000）購自英國Abcam 公司，單核細胞趨化蛋白?1（MCP?1）抗體（1 ∶100）購自美國Proteintech 公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgGⅡ抗（1 ∶5000）由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，Alexa Fluor 488 標記的山羊抗兔IgGⅡ抗（1 ∶1000）為美國Jackson Immuno Research 公司產品。（2）設備與儀器：FACSCaliburTM 流式細胞儀購自美國BD 公司，全自動生化分析儀由美國Beckman 公司提供，石蠟切片機為德國Leica 公司產品，聚合酶鏈反應（PCR）儀購自美國Applied Biosystem 公司，實時熒光定量PCR 系統(tǒng)（CEX Connect Real?Time System）由美國Bio?Rad 公司提供，GBOX?CHEMI?XT4 型曝光儀為美國Syngen 公司產品，Eclipse Ti2 型光學顯微鏡和A1MP 型熒光共聚焦顯微鏡購自日本Nikon公司。

二、實驗方法

1.實驗動物分組 18 只ApoE-/-小鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，于12 周齡時予高脂飼料和灌胃處理，采用隨機數(shù)字表法隨機分為兩組，對照組予以磷酸鹽緩沖液+ 5% Tween 80 灌 胃，Myriocin 組 予 以Myriocin 0.30 mg/（kg·d）［7］溶于磷酸鹽緩沖液+5% Tween 80灌胃，灌胃容積均為100 μl/d，以免引起小鼠胃部不適或影響進食，持續(xù)喂養(yǎng)12 周。

2. 血清脂質測定 高脂飲食和灌胃處理12 周后，摘眼球采血約800 μl，4 ℃靜置2 ～3 h，2737×g離心15 min。取上清液約200 μl，由北京大學第一醫(yī)院檢驗科完成血清脂質［包括總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL?C）、極低密度脂蛋白膽固醇（VLDL?C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL?C）］測定。

3.流式細胞術檢測單核細胞亞群比例 乙二胺四乙酸（EDTA）包被的EP 管中加入預冷磷酸鹽緩沖液400 μl；高脂飲食和灌胃處理8 周后即小鼠20 周齡 時，于 尾 靜 脈 采 血 約100 μ l；滴 加APC 標 記 的CD115 抗 體（1 ∶100）和PE 標 記 的Ly?6c 抗 體（1 ∶100）各5 μl，設立同型對照管，室溫孵育約30 min；1173×g 離心5 min，棄上清液；滴加紅細胞裂解液600 μl，振蕩混勻，相同條件離心5 min，棄上清液；滴加磷酸鹽緩沖液1 ml、振蕩重懸，相同條件下離心5 min，棄上清液，重復操作一遍；最后滴加磷酸鹽緩沖液200 μl、重懸，1 h 內上機行流式細胞術檢測，采用FlowJo 流式細胞分析軟件計算Ly?6chigh亞型單核細胞比例。

4.HE 染色和免疫熒光染色 以冷生理鹽水灌注小鼠心臟，平行左右心耳連線下方約0.50 cm 處切開心臟，將心臟基底部連同升主動脈置于4%多聚甲醛溶液固定24 h；石蠟包埋，對主動脈竇部連續(xù)切片，層厚為4 μm，脫蠟、水化。（1）HE 染色：蘇木素染細胞核4 min、伊紅染色2 min，脫水、透明、封片；采用Image?Pro Plus 圖像分析軟件定量測定主動脈斑塊面積，為避免切片角度帶來的誤差，計算斑塊相對面積［斑塊相對面積（%）=主動脈斑塊面積/主動脈竇管腔面積×100%］。（2）免疫熒光染色：切片置于pH 值為9 的抗原修復液中，94 ℃水浴15 min，10%山羊血清封閉，室溫孵育1 h，滴加MCP?1 抗體（1 ∶100）200 μl，4 ℃濕盒內過夜孵育，磷酸鹽緩 沖 液 沖 洗5 min（×5 次），滴 加Alexa Fluor 488 標 記 的 山 羊 抗 兔IgG Ⅱ抗（1 ∶1000）200 μ l，37 ℃濕 盒 內 孵 育30 min，DEPI 封片液封片，于熒光共聚焦顯微鏡下觀察MCP?1 陽性率，呈綠色熒光為MCP?1表達陽性。

5.實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測炎癥反應和整合應激反應相關分子mRNA的表達 冷生理鹽水灌注小鼠心臟，剝離主動脈、腹主動脈至髂總動脈，分為兩段，將下段血管組織置于不含RNA 酶EP 管中，迅速轉移至液氮中，再至?80 ℃冰箱保存；冰上勻漿組織，提取總RNA 10 μg，建立逆轉錄反應體系，獲得cDNA；建立熒光定量PCR 反應體系，引物序列見表1，反應總體積20 μl，包括Template 1 μl，10 μ mol/L 正 向 引 物 和 逆 向 引 物 各0.50 μ l，2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μl，RNase?free Water 8 μl；反應條件為95 ℃預熱10 min、94 ℃變 性5 s、60 ℃退 火40 s、65 ℃延 伸5 s，共40 個 循環(huán)。以β?肌動蛋白（β?actin）為內參照物，采用2-△△CT法計算炎癥反應和整合應激反應相關分子mRNA相對表達量。炎癥反應相關分子包括炎性因子白細胞介素?1β和6（IL?1β和IL?6）、腫瘤壞死因子?α（TNF?α）、細胞間黏附分子?1（ICAM?1）、血管細胞黏附分子?1（VCAM?1）、血管內皮生長因子（VEGF），以及抗炎性因子IL?10；整合應激反應相關分子包括葡萄 糖 調 節(jié) 蛋 白78（GRP78）、PERK、eIF2 α、ATF4、ATF6、內質網(wǎng)應激相關促凋亡蛋白C/EBP 同源蛋白（CHOP）和Caspase12。

6.Western blotting 法檢測整合應激反應相關蛋白表達變化 提取血管組織總蛋白，BCA 法測定蛋白總量；行十二烷基磺酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE），電壓150 V、持續(xù)時間40 min；蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，恒流200 mA、持續(xù)120 min；5%脫脂牛奶，室溫封閉1 h；滴加eIF2α、ATF4、IRE1α和磷酸化IRE1α、p65 NF?κB 和磷酸化p65 NF?κB、Caspase12（均1 ∶1000）5 ml，4 ℃搖床過夜孵育，TBST 緩沖液洗滌5 min（×5 次），滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgGⅡ抗（1 ∶5000）；滴加ECL 發(fā)光液，自動曝光成像。以β?肌動蛋白或者α?微管蛋白（α?tubulin）為內參照物，采用Image J 軟件計算目的蛋白相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR 反應引物序列Table 1. Gene?specific primers

三、統(tǒng)計分析方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。采用Levene 方差齊性檢驗檢測方差齊性，呈正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用兩獨立樣本的t 檢驗；呈非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M（P25，P75）］表示，采用Mann?Whitney U 檢驗。以P ≤0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

經(jīng)Myriocin 灌胃12 周后，小鼠血清LDL?C 水平低于對照組且差異有統(tǒng)計學意義（P = 0.012），而TC、TG、VLDL?C 和HDL?C 水平與對照組差異無統(tǒng)計學意義（均P ＞0.05，表2）。

流式細胞術分析，經(jīng)Myriocin 灌胃8 周后小鼠Ly?6chigh亞群單核細胞比例低于對照組且差異有統(tǒng)計學意義（P=0.011，表3）。

HE 染色顯示，所有小鼠主動脈竇均發(fā)生動脈粥樣硬化，但Myriocin 組斑塊面積小于對照組（圖1）。進一步定量分析，距主動脈瓣200 和300 μm處，Myriocin 組小鼠斑塊面積小于對照組且差異有統(tǒng)計學意義（P=0.045，0.003；表4）。脂質壞死核是易損斑塊的特征，Myriocin 組小鼠主動脈竇脂質壞死核相對面積小于對照組（P=0.004），表明Myriocin可有效抑制動脈粥樣硬化進展（表5）。

表2 Myriocin 組與對照組小鼠血清脂質水平的比較（±s，mmol/L）Table 2. Comparison of serum lipids between Myriocin group and control group (±s, mmol/L)

表2 Myriocin 組與對照組小鼠血清脂質水平的比較（±s，mmol/L）Table 2. Comparison of serum lipids between Myriocin group and control group (±s, mmol/L)

TC，total cholesterol，總膽固醇；TG，triglyceride，甘油三酯；LDL?C，low density lipoprotein?cholesterol，低密度脂蛋白膽固醇；VLDL?C，very low density lipoprotein?cholesterol，極低密 度 脂 蛋 白膽固醇；HDL?C，high density lipoprotein?cholesterol，高密度脂蛋白膽固醇

組別對照組Myriocin 組t 值P 值例數(shù)9 9 TC 43.48± 2.87 37.87±10.26 1.581 0.147 TG 1.01±0.20 1.22±0.34?1.572 0.135 LDL?C 9.96±1.03 8.52±1.12 2.830 0.012 VLDL?C 32.09±2.05 28.18±9.64 1.190 0.265 HDL?C 1.44±0.36 1.16±0.36 1.579 0.134

表3 Myriocin 組與對照組小鼠灌胃8 周后Ly?6chigh亞型單核細胞比例的比較（±s，%）Table 3. Comparison of the percentage of Ly?6chigh monocytes among total monocytes between Myriocin group and control group(±s, %)

表3 Myriocin 組與對照組小鼠灌胃8 周后Ly?6chigh亞型單核細胞比例的比較（±s，%）Table 3. Comparison of the percentage of Ly?6chigh monocytes among total monocytes between Myriocin group and control group(±s, %)

組別對照組Myriocin 組例數(shù)9 9灌胃8 周后61.49±10.69 49.57± 6.44 t 值2.866 P 值0.011

免疫熒光染色顯示，小鼠主動脈竇斑塊內均可見綠色熒光標記的MCP?1，但Myriocin 組MCP?1 表達水平低于對照組（圖2）。實時熒光定量PCR 顯示，與 對 照 組 相 比，Myriocin 組 小 鼠IL?1 β mRNA（P = 0.005）、TNF?α mRNA（P = 0.000）、ICAM?1 mRNA（P = 0.013）、VCAM?1 mRNA（P = 0.001）和VEGF mRNA（P = 0.037）表達水平均降低，IL?10 mRNA 表達水平升高（P=0.017），而IL?6 mRNA 組間差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），表明Myriocin 可下調炎性因子mRNA 的表達，上調抗炎性因子mRNA的表達（表6）。提示Myriocin 可有效抑制血管組織炎癥反應。

Myriocin 組小鼠整合應激反應相關分子PERK mRNA（P = 0.004）、eIF2α mRNA（P = 0.007）、ATF4 mRNA（P = 0.012）、ATF6 mRNA（P = 0.001）和Caspase12 mRNA（P = 0.000）表 達 水 平 降 低，而GRP78 mRNA 和CHOP mRNA 組間差異無統(tǒng)計學意義（均P ＞0.05，表7）。Western blotting 法顯示，與對照組相比，Myriocin 組小鼠eIF2α（P=0.047）、ATF4（P=0.011）和磷酸化p65 NF?κB/總p65 NF?κB比 值（P = 0.011）下 降，而 磷 酸 化IRE1 α/總IRE1α 比值和活化型Caspase12/總Caspase12比值組間差異未達到統(tǒng)計學意義（均P ＞0.05；表8，圖3 ～7）。表 明Myriocin 可 以 抑 制 由PERK/eIF2α/ATF4 信號轉導通路介導的整合應激反應。

討 論

Myriocin 源自一種傳統(tǒng)真菌類中藥——冬蟲夏草，其作為絲氨酸棕櫚酰轉移酶抑制劑，可抑制鞘脂合成，從而延緩動脈粥樣硬化進展［6?8］。內質網(wǎng)應激反應是整合應激反應的中心環(huán)節(jié)，在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［4］。本課題組的前期研究證實Myriocin 可延緩動脈粥樣硬化進展［6］，本研究進一步探討Myriocin 作用機制是否與抑制整合應激反應有關。關于Myriocin 的劑量，文獻報道其常用劑量為0.30 mg/（kg·d）［7?14］。Park 等［10］探討不同劑量Myriocin［0.10、0.30 和1 mg/（kg·d）］對ApoE-/-小鼠血清脂質水平和動脈粥樣硬化進展的影響，其結果顯示，Myriocin 治療12 周后0.30 mg/（kg·d）組小鼠動脈粥樣硬化面積減少93%。本研究以Park 等［10］的方案為依據(jù)，同樣采取Myriocin 0.30 mg/（kg·d）對ApoE-/-小鼠灌胃治療。

本研究經(jīng)Myriocin 灌胃治療12 周后，小鼠血清LDL?C 水平較對照組降低。已知Myriocin 藥理作用為抑制鞘脂合成，后者是脂蛋白顆粒的組成成分，因此可部分解釋Myriocin 組小鼠血清LDL?C 水平降低的現(xiàn)象。通過對主動脈竇部進行連續(xù)切片，定量分析斑塊面積和脂質壞死核面積，結果顯示，兩組小鼠主動脈竇均發(fā)生動脈粥樣硬化，但Myriocin 組斑塊面積和脂質壞死核面積小于對照組，表明Myriocin 可有效減小斑塊和脂質壞死核面積，發(fā)揮穩(wěn)定斑塊的作用。

外周血單核細胞在趨化因子的作用下，被募集進入動脈內膜。Raghavan 等［15］研究顯示，與Ly?6clow表型相比，Ly?6chigh表型單核細胞更易形成泡沫細胞。Ly?6chigh表型單核細胞亞群為經(jīng)典炎性細胞，可釋放炎性因子，如IL?1、IL?6、TNF?α和MCP?1，導致血管功能障礙和泡沫細胞聚集［16］。本研究流式細胞術分析顯示，經(jīng)Myriocin 灌胃8 周后，與對照組相比，Myriocin 組小鼠Ly?6chigh亞群單核細胞比例下降約19.39%，表明Myriocin 可有效抑制外周血Ly?6chigh表型單核細胞，進而減少泡沫細胞的形成。

圖1 光學顯微鏡觀察所見 HE 染色 ×100 1a 對照組小鼠存在主動脈竇斑塊 1b Myriocin 組小鼠主動脈竇斑塊面積小于對照組Figure 1 Optical microscopy findings HE staining × 100 Control group mice had atherosclerotic lesions in their arotic sinus(Panel 1a). The lesions were smaller in Myriocin group (Panel 1b).

表4 Myriocin 組與對照組小鼠主動脈竇斑塊相對面積的比較（±s，%）Table 4. Comparison of the percentage of plaque area between Myriocin group and control group (±s, %)

表4 Myriocin 組與對照組小鼠主動脈竇斑塊相對面積的比較（±s，%）Table 4. Comparison of the percentage of plaque area between Myriocin group and control group (±s, %)

組別對照組Myriocin 組t 值P 值例數(shù)9 9主動脈瓣33.87± 6.38 33.88±10.66?0.002 0.998距主動脈瓣100 μm 37.30±6.57 33.34±8.08 1.141 0.271距主動脈瓣200 μm 38.02± 5.06 27.60±12.74 2.281 0.045距主動脈瓣300 μm 35.38±7.00 23.79±7.03 3.506 0.003

表5 Myriocin 組與對照組小鼠主動脈竇脂質壞死核相對面積的比較［M（P25，P75），%］Table 5. Comparison of the percentage of necrotic core area between Myriocin group and control group[M (P25, P75), %]

已知炎癥與動脈粥樣硬化過程中的泡沫細胞形成和斑塊不穩(wěn)定密切相關。本研究免疫熒光染色觀察兩組小鼠主動脈竇斑塊內均可見綠色熒光標記的MCP?1，但Myriocin 組MCP?1 水平低于對照組；實時熒光定量PCR 顯示，Myriocin 組小鼠炎性因子IL?1 β mRNA、TNF?α mRNA、ICAM?1 mRNA、VCAM?1 和VEGF mRNA 低于對照組，抗炎性因子IL?10 mRNA 水平高于對照組，表明Myriocin 具有抑制血管組織炎癥反應的作用。

內質網(wǎng)應激反應可上調分子伴侶GRP78 的表達，促使GRP78 與PERK、IRE1α和ATF6 解離，啟動未折疊蛋白反應［17］；活化的PERK 可使下游底物eIF2α磷酸化，抑制蛋白質合成，同時上調ATF4 的表達［18］；長期過度應激反應可上調CHOP 的表達，導致細胞凋亡，進而促進動脈粥樣硬化進展［19］。既往研究顯示，動脈粥樣硬化發(fā)展至晚期，凋亡的巨噬細胞不能及時有效清除，繼發(fā)壞死，進一步加重炎癥反應和斑塊進展［20］。細胞器應激反應相關信號轉導通路與炎癥信號轉導通路之間存在交叉作用［21?22］。一方面，氧化修飾低密度脂蛋白（ox?LDL）可引起內質網(wǎng)應激反應，促進炎癥反應，抑制血管內皮細胞脂質流出，導致血管內皮損傷［23］；另一方面，巨噬細胞線粒體應激反應可促進炎癥反應，加重動脈粥樣硬化進展［24］。研究顯示，PERK 激活eIF2α，既可以全面下調蛋白質合成、上調ATF4 表達、促進細胞凋亡，同時還具有促進NF?κB 活化的作用［4，21］。NF?κB 信號通路在炎癥反應中發(fā)揮關鍵作用。本研究檢測整合應激反應相關分子mRNA和蛋白水平，結果顯示，Myriocin 組小鼠PERK mRNA、eIF2α mRNA、ATF4 mRNA、ATF6 mRNA 和Caspase12 mRNA，以及eIF2α、ATF4 和磷酸化p65 NF?κ B/總p65 NF?κ B 比 值 均 低 于 對 照 組，表 明Myriocin 可以抑制PERK/eIF2α/ATF4 通路介導的整合應激反應，以及NF?κB 信號轉導通路介導的炎癥反應。

圖2 熒光共聚焦顯微鏡觀察所見 免疫熒光染色 ×100 2a 對照組小鼠主動脈竇斑塊內可見MCP?1 蛋白表達（綠色熒光所示） 2b Myriocin 組小鼠主動脈竇斑塊內MCP?1 蛋白表達量低于對照組（綠色熒光所示）Figure 2 Fluorescence confocal microscopy findings Immunofluorescence staining × 100 MCP ? 1 was observed in the atherosclerotic lesions of control group (green color indicates, Panel 2a). The expression of MCP?1 was decreased in the atherosclerotic lesions of Myriocin group (green color indicates, Panel 2b).

表6 Myriocin 組與對照組小鼠炎癥反應相關分子mRNA 相對表達量的比較Table 6. Comparison of the mRNA expression levels of inflammation related molecules between Myriocin group and control group

表7 Myriocin 組與對照組小鼠整合應激反應相關分子mRNA 相對表達量的比較Table 7. Comparison of the mRNA expression levels of integrated stress response related molecules between Myriocin group and control group

綜上所述，我們認為Myriocin 延緩ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進展涉及以下機制：（1）調節(jié)脂質代謝。（2）抑制血管組織脂質攝取分子的表達，如CD36、凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體?1（LOX?1）和清道夫受體A 型（SR?A）［6］。（3）抑制炎癥反應。（4）抑制整合應激反應。Myriocin 除了抑制動脈粥樣硬化進展外，還可改善胰島素抵抗、穩(wěn)定糖代謝、緩解肝脂肪變性［25?26］。因此我們認為，經(jīng)對Myriocin 全面系統(tǒng)的藥物安全性評價，該藥物在預防與治療動脈粥樣硬化性血管病方面將有一定的臨床應用前景，可與調脂藥聯(lián)合應用，尤其適用于對調脂藥不敏感或無法耐受的患者。本研究僅為動物實驗，無細胞實驗的支持；而且未設置藥物濃度梯度、未監(jiān)測血藥濃度，所檢測的指標亦不夠全面。進一步研究將在設立藥物濃度梯度的基礎上，進行細胞水平驗證。

表8 Myriocin 組與對照組小鼠整合應激反應相關蛋白相對表達量的比較Table 8. Comparison of the protein expression levels of markers for integrated stress response between Myriocin group and control group

圖3 Western blotting 檢 測 顯 示，Myriocin 組 小鼠eIF2α表達水平低于對照組Figure 3 Western blotting showed compared with control group, Myriocin reduced the expression of eIF2α.

圖4 Western blotting 檢 測 顯 示，Myriocin 組 小鼠ATF4 表達水平低于對照組Figure 4 Western blotting showed compared with control group, Myriocin reduced the expression of ATF4.

圖5 Western blotting 檢 測 顯 示，Myriocin 組 小 鼠IRE1α磷酸化水平與對照組相比無顯著降低Figure 5 Western blotting showed the expression of phosphorylation of IRE1 α was not significantly changed.

圖6 Western blotting 檢測顯示，Myriocin 組小鼠磷酸化p65 NF?κB 表達水平低于對照組Figure 6 Western blotting showed compared with control group, Myriocin reduced the expression of p65 NF?κB.

圖7 Western blotting 檢測顯示，Myriocin 組小鼠活化Caspase12 表達水平與對照組相比無顯著降低Figure 7 Western blotting showed the expression of phosphorylation of cleaved Caspase12 was not significantly changed.

利益沖突無