楊靜涵 張智超 張丹參

河北科技大學化學與制藥工程學院，石家莊，050000，中國

神經(jīng)遞質(zhì)（neurotransmitters，NTs）廣泛分布在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和體液中，對人和動物的情緒、覺醒和認知都起重要作用。NTs 主要分為氨基酸、單胺、多肽類神經(jīng)活性物質(zhì)。NTs 濃度失衡會導致多種疾病，如抑郁癥、帕金森病、阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）等［1］。學習記憶能力下降是AD 等癡呆性疾病的主要表現(xiàn)，與腦內(nèi)氨基酸關系密切。氨基酸是含氨基和羧基的一類有機化合物的統(tǒng)稱，是蛋白質(zhì)的構件分子。氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)是腦內(nèi)重要的一類神經(jīng)遞質(zhì)，分為興奮性和抑制性兩類，人腦的功能取決于興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)之間的平衡［2］。許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病與氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)密切相關，測定它們的含量變化是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要指標［3］。

1 氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)

根據(jù)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）作用的不同，哺乳動物氨基酸類遞質(zhì)分為兩類：①興奮性氨基酸遞質(zhì)：谷氨酸（glutamic acid，Glu）、天冬氨酸（aspartic acid，Asp）等；②抑制性氨基酸遞質(zhì)：γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、甘氨酸（glycine，Gly）等。

1.1 興奮性氨基酸對神經(jīng)系統(tǒng)的作用

腦內(nèi)興奮性氨基酸（excitatory amino acids，EAA）通過位于神經(jīng)元細胞膜上的受體發(fā)揮多種生理效應，EAA 受體幾乎存在于所有神經(jīng)細胞上，在興奮性突觸傳遞、神經(jīng)元可塑性（發(fā)育、學習記憶）等方面起重要作用。

關于興奮性氨基酸興奮毒性的機理，涉及神經(jīng)元去極化，神經(jīng)元腫脹，Ca2+內(nèi)流和第二信使等一系列復雜的過程［4］。研究發(fā)現(xiàn)，EAA 對于神經(jīng)細胞具有強烈的興奮性，直接將一定量的Glu 或Asp 注入動物大腦，會引起驚厥。生理條件下，Glu 主要是作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，同時又是GABA 的前體物質(zhì)，其濃度過高會產(chǎn)生神經(jīng)毒性。此外N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-Daspartic acid，NMDA）和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionicacid，AMPA）受 體激活導致Ca2+內(nèi)流以及Ca2+在線粒體內(nèi)快速的堆積，使得線粒體功能喪失。NMDA 受體的興奮還可增加一氧化氮合酶的活性，使一氧化氮合成增加導致神經(jīng)細胞的毒性作用。Glu 作用于G 蛋白偶聯(lián)受體，抑制超極化電流，使神經(jīng)元興奮性增高，還可通過突觸調(diào)制改變Glu 自身及GABA 的釋放及突觸的可塑性，間接改變神經(jīng)元的電活動。

1.2 抑制性氨基酸對神經(jīng)系統(tǒng)的作用

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)是GABA，GABA 在腦內(nèi)廣泛分布，對GABA 敏感的神經(jīng)元主要集中于下丘腦、丘腦、大腦皮層，具有興奮抑制、抗癲癇、神經(jīng)保護的作用，臨床上許多的鎮(zhèn)靜催眠藥都是通過結合GABA 受體增強GABAA受體突觸后作用的。Gly 在調(diào)控神經(jīng)元興奮性方面也發(fā)揮重要的作用，Gly 能神經(jīng)元主要集中在脊髓和腦干，而且在間腦和中腦也有表達。Gly 的受體和GABAA受體屬同一家族，作用與GABA 類似，主要功能是對運動和感覺抑制性調(diào)控。

GABA 能夠降低大腦興奮性從而抑制突觸傳遞。研究表明Glu/GABA 比值過高會產(chǎn)生細胞毒性作用，導致神經(jīng)元受損出現(xiàn)認知障礙，而比值過低也會抑制突觸可塑性形成和記憶的存儲［2］。

2 腦內(nèi)氨基酸含量測定的方法

目前，腦內(nèi)氨基酸含量測定的方法有氨基酸分析儀測定法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細管電泳法、氣相色譜法等，現(xiàn)對這些方法進行歸納總結，以期為研究者準確快速測定腦內(nèi)氨基酸含量提供參考［5］。

2.1 氨基酸分析儀測定法

基于Moore 和Stein 的工作，專屬性較強的氨基酸分析儀得以問世［6］。氨基酸分析儀作為一種專門用來分析氨基酸的液相色譜儀，基本結構和普通的高效液相色譜相似，在離子交換色譜的原理指導下制成，通常采用磺酸型陽離子樹脂分離。用于氨基酸分析儀的樣品都需用pH 為2.2 的緩沖液溶解配制，因為血液中氨基酸在低pH 的條件下都是帶正電荷的，陽離子樹脂本身帶有負電荷，兩者正負相互吸引結合，且氨基酸所帶正電荷越多，結合的越緊密。不同氨基酸與離子交換樹脂親和力由強到弱依次為：堿性氨基酸>芳香族氨基酸>中性氨基酸>酸性及羥基氨基酸，實現(xiàn)對氨基酸的分離之后，采用茚三酮衍生，可見光光度檢測，實現(xiàn)了對氨基酸檢測的目的。此種基于柱后茚三酮衍生、離子交換色譜原理制成的氨基酸分析儀被認為是生物樣品中氨基酸分析的金標準，因此，氨基酸分析儀仍然是目前臨床實驗室中最常用的方法，該方法主要缺點是分析時間長和樣品用量大。

氨基酸分析儀也可利用陰離子交換分離后經(jīng)積分脈沖安培法原理檢測，該檢測方法無需將待測氨基酸進行柱前或柱后衍生，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性與高效液相色譜法接近，但其易受血液樣品中蛋白、糖類、細菌等的干擾，測定血液氨基酸含量時的準確度稍低［7］。血液中的氨基酸用專屬儀器進行檢測，樣品前處理較為簡單，在血清中加入6%磺基水楊酸沉淀蛋白，離心（3 000 r·min-1）15 min，取上清液稀釋后即可上機分析。Smon 等［8］用氨基酸分析儀分析兒童血漿中的14 種氨基酸，該方法重復性好，分辨率高，可以檢測具有代謝疾病患者的氨基酸水平。從氨基酸分析儀整體性能來看，此類儀器技術門檻較高，多依賴于進口，價格較貴，較長的分析時間（2.5 h），靈敏度與高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）柱前衍生方法相比稍低（HPLC：<0.5 pmol；氨基酸分析儀：<10 pmol），但該檢測方法在操作簡便性、分離度、重現(xiàn)性、運行成本等方面都優(yōu)于其他分析方法。

2.2 高效液相色譜法

HPLC 是在20 世紀60 年代末70 年代初發(fā)展起來的一種新型現(xiàn)代分離分析測試技術，經(jīng)過不斷改進，現(xiàn)如今已成為應用廣泛的化學分離分析技術手段。它在經(jīng)典液相色譜基礎上，引入氣相色譜理論，采用高壓泵、高效固定相及高靈敏檢測器，因而具備“四高一廣”的特點，即高壓、高速、高效、高靈敏度和應用范圍廣。進樣方法也越來越自動化，從之前的手動進樣到現(xiàn)在全自動進樣，并且高效液相色譜對化合物結構的破壞性小，適合有機分子及生物分子分離分析。

HPLC 或毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）通常會結合各種檢測方法，如紫外檢測（ultraviolet，UV），熒光檢測法（fluorescence detection，F(xiàn)LD），電化學檢測（electrochemical detection，ECD），激光誘導熒光檢測，化學發(fā)光檢測（chemiluminescence，CL）和質(zhì)譜法（mass-spectrography，MS）。然而，UV、FLD 和CL檢測對多個氨基酸和NTs 檢測靈敏度差，且由于電極污染，ECD 檢測重現(xiàn)性差。因為檢測基于分子質(zhì)量和化學結構，質(zhì)譜法在分析選擇性方面具有顯著優(yōu)勢。

液相色譜中熒光檢測器的靈敏度要比紫外檢測器高，近年來，越來越多的研究人員選擇熒光檢測器確定血液或組織樣品中氨基酸的含量，但是液相色譜能分離檢測的對象，多數(shù)沒有熒光，主要依靠熒光衍生化試劑通過衍生化反應在目標化合物上接上能發(fā)出熒光的生色基團，達到熒光檢測的目的。張夏薇等［9］使用高效液相-紫外檢測器，結合柱前衍生的方法檢測出了腦組織樣品中四種氨基酸的含量，線性關系良好。白潔等［10］采用柱前衍生-高效液相色譜法同時測定血清中氨基酸類及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，除了單胺類神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）的檢測限未達到要求，?；撬幔╰aurine，Tau）、Glu、Gly、γ-GABA 各項指標均良好。

2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）分析法是通過將待測物質(zhì)的原子或分子在高速電子流的沖擊下轉變帶正電荷的離子，然后經(jīng)加速運動形成離子流，離子流在磁場（或同時在電場和磁場）的作用下，按照各種離子的質(zhì)量與其所帶電荷量的比值，即質(zhì)荷比（m/z）大小順序分離開來，形成有規(guī)律的質(zhì)譜圖，并用檢測器記錄下來，進行定性、定量、結構分析的方法。質(zhì)譜法幾乎是唯一一種能夠準確確定有機化合物分子式的方法。質(zhì)譜法分析靈敏度高，比紫外或熒光檢測器的靈敏度要高1～2 個數(shù)量級以上，檢出限可達10-14g 數(shù)量級，適用于痕量分析［11］。此外，質(zhì)譜法可以提供豐富的分子碎片信息，用于分子結構分析［12］。

在色譜-質(zhì)譜法中，質(zhì)譜可以和氣相聯(lián)用如GC/MS，也可以和高效液相聯(lián)用如HPLC/MS。并且對于質(zhì)譜檢測器，衍生化過程不是必需的，但為提高血液樣品中氨基酸檢測的靈敏度和特異性，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法也常采用一些衍生劑。黃鑫等［13］建立了超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法檢測大鼠海馬和大腦皮層中生物胺類及氨基酸類神經(jīng)化學物質(zhì)含量的方法，電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）在正離子模式下，選擇多反應監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）掃描，對檢測的6 種生物胺類和11 種氨基酸類神經(jīng)化學物質(zhì)分別選擇一個定性離子對和一個定量離子對。測定wistar 大鼠海馬和大腦皮層中6 種生物胺類和11 種氨基酸類神經(jīng)化學物質(zhì)的含量，對比兩種不同腦組織樣品前處理方法對神經(jīng)化學物質(zhì)含量測定結果的影響。無需衍生化，17 種神經(jīng)化學物質(zhì)在10 min內(nèi)即可完成同時測定，檢測方法線性關系良好，日內(nèi)和日間精密度、加標回收率和重復性滿足分析要求。由于色譜和質(zhì)譜靈敏度相當，另外分離效果很好的色譜可作質(zhì)譜的進樣系統(tǒng)，質(zhì)譜作為色譜的鑒定儀器分析速度快，分離好，應用廣。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用成為最好的用于分析微量有機混合物的儀器。

2.4 毛細管電泳法

毛細管電泳法（capillary electrophoresis，CE）是以彈性石英毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術，具有分析效率高、分析時間短的優(yōu)點，其基本原理是根據(jù)帶電物質(zhì)在電場中的電遷移率不同來對混合物進行分離［14］。由于質(zhì)譜的選擇性和專一性可彌補樣品遷移時間的不足，同時提供分子量和結構信息，在毛細管電泳法對于生物樣本的分析中，采用質(zhì)譜檢測比UV 檢測或電化學檢測更通用。毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用法可以為分析體積少的血液樣品（如干燥的血斑）提供氨基酸譜分析的高效微量分離平臺。相關研究［15］采用毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用法，對血漿中的高半胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和谷氨酸的含量進行檢測并定量，采用二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）和乙腈沉淀蛋白，結果顯示，準確度重現(xiàn)性均較好。另有研究表明［16］，毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用可在3 min 內(nèi)有效地檢測血液樣品中的苯丙氨酸，用于篩查新生兒苯丙酮尿癥，僅需采用極少的血液樣本量，即可展現(xiàn)較高的靈敏度和準確性。采用此種方法，蛋白質(zhì)的去除是關鍵，血漿中蛋白質(zhì)會吸附在毛細管壁上，出現(xiàn)蛋白質(zhì)變性和毛細管堵塞等問題。

2.5 氣相色譜法

氣相色譜法分析氨基酸前首先需要將氨基酸衍生為易于氣化的衍生物。趙楠等［17］探究了氣相色譜結合負化學離子源質(zhì)譜（GC-NCI-MS）法對脂肪酸、有機酸、氨基酸的同時定性、定量方法，并且對氯甲酸酯類和硫酸-甲醇溶液兩種衍生方式做了比較。Hanff 等［18］采用氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法測定血漿中的氨基酸，先用酸化的甲醇溶液將氨基酸酯化，再用酸酐進行酰胺化，以實現(xiàn)電子捕獲型負離子化學電離，氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法具有選擇性好、分離時間短、靈敏度高的優(yōu)點，但其衍生步驟復雜、衍生反應干擾多，不適用于不耐熱氨基酸，不能用一根色譜柱實現(xiàn)全氨基酸測定，目前在血液氨基酸測定方面應用并不廣泛。

3 衍生化試劑在氨基酸含量測定中的應用

液相色譜中熒光檢測器的靈敏度要比紫外檢測器高，但是液相色譜能分離檢測的對象，多數(shù)沒有熒光，主要依靠熒光衍生化試劑通過衍生化反應在目標化合物上接上能發(fā)出熒光的生色基團，達到熒光檢測的目的，常用的衍生劑有異硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）、2，4-二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、9-芴脂（9-fluorenylmethyloxycarbonyl，F(xiàn)MOC）、OPA-FMOC聯(lián)用、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）、6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞氨基甲酸酯（6-aminoquinoline-N-hydroxylsuccinyl carbamate，AQC）等［19］。DNFB 衍生過程中能夠產(chǎn)生對測定結果有干擾的副產(chǎn)物，PITC 衍生試劑具有揮發(fā)性且具有較大毒性，需真空干燥裝置去過量衍生劑；FMOC 衍生過量的反應劑必須用戌烷萃取除去［20］；OPA 衍生產(chǎn)物在室溫不穩(wěn)定，分解率高；Dansyl-Cl 反應活性較差，反應速度慢，且易生成多級衍生產(chǎn)物干擾測定。AQC 可與伯胺和仲胺反應生成穩(wěn)定的衍生物脲，其衍生物有很強的紫外吸收和熒光吸收，衍生操作簡單，衍生速度快，過量的試劑能自然水解，不需要特殊的處理或提??；而且還不受樣品基質(zhì)、大量電解質(zhì)、維生素和微量元素的干擾，特別適用于食品等復雜基質(zhì)中氨基酸的分析［21］。

傳統(tǒng)衍生化試劑在應用中有或多或少地限制，如穩(wěn)定性差、檢測靈敏度低，操作不便，衍生化試劑的合成困難，色譜分離干擾嚴重等。繼續(xù)開發(fā)新型質(zhì)譜增敏衍生試劑用于復雜基質(zhì)中痕量物質(zhì)的溫和、快速、靈敏度高、多種成分同時檢測分析，具有十分重要的意義。

綜上，血液和組織中的氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)檢測技術主要有氨基酸分析儀、高效液相色譜儀及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀等。GB 5009.124-2016 采用的是離子交換茚三酮柱后衍生的方法，該方法中使用的氨基酸自動分析儀價格昂貴，用途專一，靈活性差，大大限制了其推廣和使用。而液相色譜分析法，普適性廣，具有分析速度快，靈敏度高，操作簡單等優(yōu)點，已成為檢測氨基酸的首選方法。因氨基酸和?；撬釋儆跇O性大且無紫外吸收的一類化合物，故需進行衍生化。當今，基于質(zhì)譜法的技術越來越多的用于生物樣品的多種代謝物分析，以進行靶向代謝組學研究。超高壓液相色譜是一種新型液相色譜技術，可顯著改善色譜峰的分離度和檢測靈敏度，同時大大縮短分析周期。超高壓液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（ultra high pressure liquid chromatography mass spectrometry，UPLC-MS）已經(jīng)成為氨基酸分析的一種很有前景的方法［22］。超高效液相色譜與多重反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式的串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）結合，可在短時間內(nèi)進行色譜分離，快速、靈敏和特異性地定量多種分析物。