王波,張然然,楊如意*,石曉菁 ,蘇楠楠,朱濛,昝樹婷
(1.安徽師范大學生態(tài)與環(huán)境學院,安徽 蕪湖 241002;2.安徽省水土污染治理與修復工程實驗室,安徽 蕪湖 241002;3.皖江流域退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復與重建省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,安徽 蕪湖 241002)
近年來,隨著工業(yè)化和城市化進程的加快,礦山開采、重金屬冶煉、污泥施用等人類活動使土壤重金屬污染問題日益嚴重[1]。2014年發(fā)布的《全國土壤污染狀況調查公報》顯示,我國耕地土壤的點位超標率達19.4%[2],其中,鎘的超標率最高,達7%。鎘在全國水稻土中的濃度介于0.01~5.50 mg·kg-1,中位值為0.23 mg·kg-1[3]。同時,鎘也是毒性最強、危害最大的重金屬之一。鎘已被國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer,IARC)列為一類致癌物,對作物生長也具有顯著抑制作用,引起了國內外學者的廣泛關注[4-5]。
硒是人類和其他動物必需的微量元素之一,具有抗氧化、抗癌、增強免疫力等多種功能[6]。近年來,大量研究表明,硒與鎘、汞、砷、銻等重金屬存在拮抗作用,能夠降低重金屬活性,從而減少作物對重金屬的積累[7-10]。但是,硒與重金屬的相互作用與硒的施用量、形態(tài)、施用方式、施用時間,以及土壤背景值等多種因素有關,過量的硒可能加重鎘的毒性[11]。土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要活性組分,對重金屬的遷移、轉化、生物富集等過程有重要影響[12]。研究發(fā)現,許多微生物可以在厭氧或好氧狀態(tài)下將硒酸鹽或亞硒酸鹽還原為納米單質硒(Se nanoparticles,SeNPs),且納米單質硒也具有較強的抗氧化作用,并能與重金屬結合形成難溶的復合物[13-15]。例如:一種土壤中分離的假單胞菌在液相介質中可以將亞硒酸鹽和鎘離子轉化為納米CdSe,從而將硒和鎘同時從液相介質中去除[16]。與此類似,在線蟲體內微生物也可以合成納米CdSe,并將其排出體外,顯著降低鎘的毒害作用[17]。此外,根際微生物還會影響植物對硒的積累[18-19],并改變硒在植物體內的分布和賦存形態(tài)[20]。但截至目前,在鎘污染土壤中能否利用硒和土壤微生物實現鎘的原位鈍化,以保障食品安全,國內外相關報道還很少。
人類活動和地質條件是造成重金屬污染的兩大原因,地質高背景區(qū)土壤中的重金屬受自然過程和人為活動的共同影響,其生物地球化學過程、作物富集特征、健康效應與人為污染區(qū)存在顯著區(qū)別[21-22]。本研究團隊從硒鎘高背景區(qū)稻田土壤中分離到一株耐硒的賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus macrolides),該菌對亞硒酸鹽的還原效率、還原率和耐受水平均遠高于已報道的絕大多數細菌[13]。該耐硒細菌一方面通過還原亞硒酸鹽降低了土壤中硒的有效性,另一方面也可能在土壤中形成納米CdSe,從而降低鎘的有效性。因此,其對硒鎘高背景土壤中硒和鎘的有效性,以及植物硒、鎘積累的影響值得深入研究。本研究通過盆栽試驗,探討了施用外源硒和接種該耐硒細菌對鎘脅迫下水稻生理代謝、生長和硒鎘積累的影響。本研究結果可以為硒鎘高背景區(qū)富硒資源的科學、合理利用,以及安全、優(yōu)質農產品的生產提供科學依據。
供試土壤(0~20 cm的表土)取自安徽省石臺縣仙寓鎮(zhèn)大山村天然富硒稻田(30°01′22″N,117°21′35″E),該土壤鎘背景值較高(0.19~1.82 mg·kg-1)。土壤取回后剔除枯枝落葉和碎石等雜質,風干后過5 mm的尼龍篩。供試土壤的pH為6.18,有機質含量為34.14 g·kg-1,總磷和有效磷含量分別為 0.89 g·kg-1和22.50 mg·kg-1。土壤中硒、銅、鎘、鉛的總量分別為0.79、14.80、0.58 mg·kg-1和41.57 mg·kg-1。水稻生長基質按照石英砂∶土=3∶1(質量比)混勻,121℃高壓蒸汽滅菌20 min,老化一周后使用。本試驗選用的水稻(Oryza sativa L.)為雜交秈型兩優(yōu)6號,購于蕪湖市種子公司。該品種在皖南地區(qū)種植面積廣泛,具有穗大粒多、高抗白葉枯病、高抗感稻瘟病等特點。本試驗所用的耐硒細菌為一株好氧的、格蘭氏陽性L.macrolides DS15菌株,分離自大山村天然富硒土壤中的水稻根際。Na2SeO3對DS15的最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)為 220 mmol· L-1,DS15能夠在36 h內將1.0 mmol·L-1的Na2SeO3全部還原為納米單質硒,還原產物的平均粒徑為162 nm,形態(tài)為無定形硒[13]。
本試驗為兩因子交叉設計,兩個因子分別為施硒處理和接種耐硒細菌處理(接種DS15或滅菌,分別記為+DS和-DS)。將滅菌后的生長基質置于口徑為17.0 cm、底徑為11.8 cm、高為14.5 cm的塑料盆中,每盆裝2.0 kg,向生長基質中加入配制好的CdCl2水溶液,使生長基質中鎘的濃度達到2 mg·kg-1,待生長基質風干后分別按 0、0.5、2.0 mg·kg-1的施用量加入配制好的Na2SeO3水溶液,分別記為CK、LO和HI。盆栽試驗中硒和鎘的施用劑量均按照該富硒高鎘土壤中硒、鎘的背景值設定[13]。將L.macrolides DS15菌株接種于LB培養(yǎng)基中,在30℃、180 r·min-1條件下搖床培養(yǎng)48 h,離心菌液收集菌體,并用無菌水稀釋100倍備用,然后將擴繁稀釋后的L.macrolides DS15菌株菌液均勻噴灑到生長基質表面并混勻。接種的菌液濃度為6×106CFU·mL-1,每盆生長基質接種菌液的量為100 mL。水稻種子在催芽前先用0.5%的NaClO進行消毒處理,然后用蒸餾水清洗3次,在氣候培養(yǎng)箱中催芽后播種于塑料盆中,每盆植株的總數為6株。本試驗共6個處理,每個處理設4次重復(n=24)。水稻在溫室中進行培養(yǎng),塑料盆按完全隨機區(qū)組進行擺放,且每周調換位置,避免溫室環(huán)境不一致造成的誤差。溫室中保持自然光照和溫度,溫度范圍在18~32℃。為保證水稻的正常生長,試驗期間添加兩次Hoagland營養(yǎng)液。
水稻種植4個月后進行取樣,取少許葉片測定其鮮質量,同步測定總葉綠素含量和抗氧化物酶活性。將新鮮的水稻葉片剪成碎片后稱取0.2 g,加入體積比為1∶1的丙酮和乙醇的提取液10 mL,待水稻葉片完全變白,在663 nm和645 nm的波長下測定吸光度,計算葉綠素含量(Chlorophyll,CHL)。丙二醛(Malonyldialdehyde,MDA)含量采用硫代巴比妥酸(0.5%thiobarbituric acid,TBA)法測定[23]。取0.2 g新鮮水稻葉片將其剪成1~2 cm的碎片后置于研缽中,接著加入1.5 mL pH為7.8、濃度為0.05 mmol·L-1的磷酸緩沖液研磨成勻漿,然后轉移至離心管中,在低溫高速離心機中進行離心,上清液即酶液。超氧化物歧化酶(SOD)用氮藍四唑光化還原法測定[24],過氧化氫酶(CAT)用過氧化氫分解量法測定[25]。
將水稻整株從塑料盆中取出,抖動根部,用毛刷將根表附著的土壤輕輕取下作為根際土壤[26]。根際土壤有效鎘用二乙烯三胺五乙酸(Diethylenetriaminepentaacetic acid,DTPA)浸提,火焰原子吸收法測定[27]。用自來水和蒸餾水分別清洗水稻植株,拍照后晾干稱質量。將水稻植株分為地上部分和根部,測定地上部分和根部的長度,然后放入烘箱中60℃烘干至恒質量,測定干質量。水稻總生物量根據樣品總鮮質量,剩余樣品鮮質量和干質量進行計算。水稻樣品粉碎后過100目篩,水稻鎘含量采用火焰原子吸收法測定[27],水稻硒含量采用微波消解原子熒光法測定[28]。水稻籽粒中鎘的積累主要受鎘從根部向地上部分轉移過程的影響[29],轉移系數按下式計算:
試驗數據均采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。首先,進行雙因素方差分析(Two-way ANOVA),闡明添加外源硒和接種耐硒細菌兩個因子的主效應和因子間的交互作用。其次,進行單因素方差分析(Oneway ANOVA),探明單個因子的影響。不同處理間的差異采用最小顯著性差異法(Least significant difference,LSD)進行多重比較。在方差分析之前先進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗,顯著性水平為5%。
雙因素方差分析表明,施硒對水稻總生物量和根長的影響不顯著,但外源硒可以明顯提高水稻的株高(R2=0.725,P<0.01,圖1a),低硒處理中水稻的株高達到最大值,與對照相比提高了39.74%;高硒處理中水稻的株高比對照增加了18.65%,但顯著低于低硒處理(P<0.01)。單因素方差分析與雙因素方差分析的結果類似,無論是否接種DS15菌株,水稻株高均表現為低硒處理>高硒處理>對照(圖1a)。
接種DS15對水稻株高和根長均無明顯影響,但生物量與滅菌處理相比增加了178.79%(R2=0.852,P<0.01)。單因素方差分析結果顯示,外源硒對水稻生物量的影響不顯著。接種DS15使水稻生物量在CK、LO、HI 3個硒處理中分別比滅菌處理增加了163.51%、213.33%和175.81%,均達到極顯著水平(P<0.01,圖1b)。
對于水稻的生長,硒處理和接種DS15菌株兩個因子間均無明顯的交互作用。
圖1 外源硒和接種耐硒細菌對水稻株高和生物量的影響Figure 1 Effect of exogenous selenium(Se)application and inoculation with Se-tolerant bacterium on shoot height and biomass of rice
雙因素方差分析表明,外源硒、耐硒細菌,以及因子間的交互作用對水稻MDA含量均無顯著影響(圖2a)。單因素方差分析顯示,在不接種DS15時,低硒處理的MDA含量顯著低于高硒處理(P<0.01),但施硒處理與對照之間無顯著差異;當接種DS15后,外源硒對水稻MDA含量無顯著影響。在所有硒處理中,接種DS15對水稻MDA含量均無顯著影響(圖2a)。
雙因素方差分析顯示,外源硒顯著影響水稻總葉綠素含量(R2=0.420,P<0.05,圖2b),低硒處理顯著低于對照。單因素方差分析的結果與MDA含量類似,在不接種DS15時,低硒處理的總葉綠素含量顯著低于對照和高硒處理(P<0.05)。同樣,在所有硒處理中接種DS15對水稻總葉綠素含量均無顯著影響(P>0.05,圖2b)。
硒處理、接種處理,以及兩者的交互作用對水稻SOD活性均有顯著影響(R2=0.806,P<0.05),外源硒顯著降低SOD活性,而接種耐硒細菌的作用剛好相反(圖2c)。單因素方差分析表明,接種DS15時施硒處理的水稻SOD活性均顯著低于對照(P<0.01),而不接種情況下僅高硒處理的SOD活性顯著低于對照(P<0.01)。對照處理中,接種DS15顯著增加水稻SOD活性,但是在施硒處理中接種DS15的作用不明顯(圖2c)。
CAT活性主要受硒處理和接種處理共同影響,外源硒降低水稻CAT活性,而接種耐硒細菌會提高CAT活性(R2=0.572,P<0.05),其變化趨勢與SOD活性相似,相比而言接種處理對CAT活性的影響更顯著。單因素分析表明,接種DS15時,低硒處理使水稻CAT活性顯著降低(P<0.01),但高硒處理的作用不明顯;不接種條件下,施硒對CAT活性的影響未達到顯著水平。接種DS15使CAT活性趨于升高,在對照和高硒處理中達到顯著水平(P<0.05,圖2d)。
硒處理和接種處理對根際土壤鎘有效性均有顯著影響(R2=0.548,P<0.05),外源硒和接種耐硒細菌均顯著降低鎘有效性(圖3a)。接種DS15時,施硒處理顯著降低根際土壤鎘有效性(P<0.05),降幅分別達50.65%和28.31%;不接種DS15時,硒處理對根際土壤鎘有效性的影響不顯著。施硒處理中,接種DS15使根際土壤中鎘的有效性顯著降低,低硒和高硒處理中降幅分別達38.09%和28.95%(P<0.05,圖3a)。
圖2 外源硒和接種耐硒細菌對水稻MDA、葉綠素含量及SOD、CAT酶活性的影響Figure 2 Effect of exogenous selenium(Se)application and inoculation with Se-tolerant bacterium on MDA,chlorophyll contents and SOD,CAT activities of rice
添加外源硒,以及硒處理與耐硒細菌的交互作用對水稻根部鎘含量有極顯著影響(R2=0.803,P<0.01,圖3b),低硒處理中水稻根部鎘的含量顯著低于對照和高硒處理(P<0.01)。從單個因子的影響來看,當接種DS15時,根鎘含量在不同硒處理之間均有顯著差異,表現為低硒處理<高硒處理<對照;但不接種DS15時,對照和低硒處理均顯著低于高硒處理。在對照和高硒處理中,接種DS15對根鎘含量均有顯著影響,但高硒處理中接種DS15顯著降低根鎘含量,而對照則剛好相反,這與根際土壤中鎘有效性的變化趨勢一致(圖3b)。
硒處理、接種處理和兩者的交互作用對水稻地上部分鎘含量有極顯著影響(R2=0.931,P<0.01),施硒和接種DS15使地上部分鎘含量趨于降低(圖3c)。從單因素方差分析結果看,接種DS15時,施硒處理的地上部分鎘含量比對照分別降低77.19%和76.12%;不接種DS15時,3個硒處理中地上部分鎘含量均有顯著差異,依次為高硒處理>對照>低硒處理。在施硒處理中,接種DS15可降低地上部分鎘含量,但僅在高硒處理中達到極顯著水平(P<0.01,圖3c)。
鎘的轉運系數(Transportation factor,TF)均小于27%,并受施硒處理、接種處理和兩者交互作用的顯著影響(R2=0.855,P<0.01,圖3d),施硒和接種DS15使鎘向地上部分的轉運趨于降低。接種DS15時,施硒處理顯著減少鎘的轉運;不接種DS15時,僅低硒處理可顯著降低鎘的轉運(圖3d)。接種DS15均使鎘的運輸呈下降趨勢,其中在高硒處理中達到極顯著水平(P<0.01)。
硒處理、接種處理和兩者的交互作用對水稻根部(R2=0.985,P<0.05)和地上部分硒的積累(R2=0.992,P<0.01)均有顯著影響,但硒的轉運主要受硒處理控制(R2=0.864,P<0.01),接種DS15的影響不明顯(圖4)。單因素方差分析的結果表明,無論是否接種DS15,水稻中硒的含量均隨著施硒水平的增加而升高(圖4a、圖4b);低硒處理對硒的轉運影響不明顯,但高硒處理使硒向水稻地上部分的轉運顯著增加(圖4c)。在高硒處理中,接種DS15使地上部分的硒含量,以及硒的轉運顯著降低,而低硒處理中接種DS15使水稻根部硒含量顯著增加,對照中接種DS15對水稻硒含量和轉運的影響不明顯。
圖3 外源硒和接種耐硒細菌對水稻根際有效鎘、根部和地上部鎘含量、鎘轉運的影響Figure 3 Effect of exogenous selenium(Se)application and inoculation with Se-tolerant bacterium on cadmium(Cd)availability in rhizosphere of rice,root and shoot Cd contents,and Cd transportation
地質高背景區(qū)土壤中重金屬的富集往往具有顯著的母巖繼承性,其中在廣西、貴州、云南等省份廣泛分布的喀斯特碳酸鹽巖地區(qū)是典型的鎘地球化學異常區(qū)[30-31]。另外,我國發(fā)現的富硒土壤多數發(fā)育于寒武系的黑色頁巖,通常也具有硒鎘背景值較高的特征[21,32-33]。近年來,硒與重金屬之間的相互作用已成為環(huán)境與健康研究領域的熱點問題之一。雖然目前已有大量研究證實了硒鎘存在拮抗作用,但絕大部分研究成果都是來自盆栽試驗,硒和鎘的施用量、形態(tài)都與硒鎘高背景區(qū)存在顯著差異。本研究發(fā)現,添加外源硒能夠促進水稻地上部分的伸長,顯著增加水稻硒含量和硒向地上部的運輸,但總生物量并無顯著變化。接種耐硒細菌顯著增加了水稻生物量,這說明該細菌不僅影響硒的形態(tài),可能還具有一定的促生作用[34]。從對植物生理和生長的影響而言,適量的硒可以緩解鎘脅迫引起的氧化應激反應,減少鎘的積累,但過量的硒有可能進一步加重鎘的毒害效應[11]。在不接種耐硒細菌時,低硒處理中水稻MDA含量顯著低于高硒處理,而施硒處理與對照相比MDA含量的變化不明顯。硒與鎘的相互作用不僅取決于兩者的總量,也與其存在形態(tài)、比例關系密切相關[35]。本研究所用土壤硒背景值較高,而過高的硒對水稻等作物會產生一定脅迫[11],這可能是導致施硒處理對MDA含量影響不明顯的重要原因之一。另外,由于耐硒細菌可以將亞硒酸鹽還原成納米單質硒,因此在一定程度上會減弱硒對鎘的拮抗作用。本研究發(fā)現,在不接種DS15菌株時,低硒處理對葉綠素的合成產生了明顯的抑制作用,但高硒處理反而未產生抑制,這種現象目前報到較少,其原因尚不明確。多數情況下,適量的硒處理會增加鎘脅迫下葉綠素的含量,但硒濃度過高則會對葉綠素合成產生顯著抑制[36]。然而,趙園園[37]發(fā)現,1 μmol·L-1的低硒處理對鎘脅迫下油菜L338的葉綠素總量產生了明顯抑制,但高硒處理與對照無顯著差異,其結果與本研究基本相同。從水稻葉片的MDA含量可以看出,低硒處理中MDA含量最低,因此葉綠素合成受到抑制并不是氧化脅迫造成的,這可能跟不同的作物品種對硒、鎘劑量的差異化響應有關[37]。外源硒顯著降低SOD和CAT活性,但相對而言外源硒對CAT活性的影響較小,在不接種情況下CAT活性變化不明顯,這與前人的研究結果是一致的[11],可能是因為CAT與鎘的解毒作用關系不大。本研究結果顯示,接種耐硒細菌可能具有雙重作用,一方面導致硒的有效性下降,從而使對照處理中SOD活性、對照和高硒處理中CAT活性均顯著高于不接種處理(圖2c、圖2d);另一方面,這些亞硒酸鹽還原菌有可能會通過合成納米CdSe而降低鎘的有效性[16],起到鈍化鎘的作用,從而降低了水稻植株對鎘的積累和運輸(圖3)。同時,這兩方面作用的綜合結果與土壤硒水平密切相關。在高硒處理中接種DS15使土壤鎘有效性顯著下降,水稻的鎘積累量和鎘的運輸也顯著降低;但是,在對照處理中接種DS15的作用卻與此相反,水稻根際有效鎘增加了10.83%,根部鎘積累量極顯著增加。同樣,外源硒也顯著降低根際土壤中鎘的有效性,以及水稻植株對鎘的吸收和運輸,其作用效果均在低硒處理中達到最佳。最近的研究表明,外源硒減少水稻對鎘的積累可能與促進根系泌氧,增強根表鐵膜的阻隔作用有關[38]。但是,由于本研究未獲得籽粒鎘的數據,而且水稻籽粒積累鎘的過程受多種因素影響[29,39],因此無法通過植株中鎘的積累量預測外源硒和接種耐硒細菌是否能降低籽粒中鎘的積累量。前期研究發(fā)現,硒鎘高背景區(qū)土壤中硒對水稻和茶葉中鎘的積累量無顯著影響[21,40],這與大量盆栽試驗的結果有明顯不同。Zhang等[35]發(fā)現,在硒鎘高背景區(qū)土壤中有效態(tài)硒鎘的摩爾比對玉米的鎘積累量有顯著影響,當比值較大時(≥0.7)會阻礙鎘的吸收,葉片中硒代蛋氨酸與鎘相結合;反之,當比值較小時(<0.7)則會增加玉米對鎘的積累量,葉片中硒代胱氨酸與鎘共存。大山村地區(qū)土壤有效硒平均占比小于6%[41],茶園土壤中有效硒為17.54%,而有效鎘為57.31%[21],這可能是硒鎘拮抗現象不明顯的重要原因之一。
圖4 外源硒和接種耐硒細菌對水稻地上部、根部硒含量、硒轉運的影響Figure 4 Effect of exogenous selenium(Se)application and inoculation with Se-tolerant bacterium on root and shoot Se contents of rice,and Se transportation
本研究結果表明,外源硒對鎘脅迫下水稻生長、生理代謝和鎘積累的影響與其施用量密切相關。耐硒細菌會影響硒和鎘的有效性,減少鎘的吸收和運輸,但可能對抗氧化酶產生不利影響,硒鎘高背景區(qū)土著微生物的作用值得關注。
(1)外源硒可以促進水稻地上部分伸長,接種耐硒細菌能夠增加水稻生物量。
(2)外源硒和耐硒細菌對丙二醛(MDA)含量的影響不明顯,外源硒顯著降低超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性,而接種耐硒細菌的作用剛好相反,這可能跟耐硒細菌對亞硒酸鹽的轉化有關。
(3)外源硒顯著增加水稻對硒的積累和運輸,降低根際土壤鎘活性,減少了水稻對鎘的積累和運輸。硒處理均在低濃度下效果最佳,不接種DS15時過量施用硒會增加水稻的鎘積累量。
(4)高硒處理中,接種耐硒細菌使水稻地上部分硒含量顯著降低,但對根際土壤鎘具有鈍化作用,因此降低了水稻對鎘的積累和運輸。