羅 銀，劉 峰

（湖南大學(xué)研究生院隆平分院/湖南省蔬菜研究所，長(zhǎng)沙 410125）

隨著時(shí)代的發(fā)展，DNA測(cè)序技術(shù)（DNA sequencing）正不斷進(jìn)步與完善，水稻、玉米、番茄等多種作物已完成基因組測(cè)序［1～3］。如今科研工作者們將目光更多地集中在該怎么去解讀大量的基因組信息、功能以及該如何對(duì)基因組進(jìn)行精準(zhǔn)而又高效的修飾，因此當(dāng)基因組編輯技術(shù)問世時(shí)便舉世矚目。基因組編輯技術(shù)（Genome editing）是一種借助序列特異核酸酶（Sequence-specific nucleases，SSNs）對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行精確定點(diǎn)修飾的技術(shù)，可以使靶位點(diǎn)的堿基發(fā)生替換、缺失、插入等的改變。目前SSNs主要有4種類型，即歸巢核酸酶（Mega nucleases，MNs）、鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effect or nucleases，TALENs）和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9，CRISPR/Cas9 system）［4～12］。這些SSNs可以在靶位點(diǎn)切割序列，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（Double strand breaks，DSBs），激活細(xì)胞內(nèi)的兩種DNA損傷修復(fù)途徑：非同源末端連接（Non-homologous ending-joining，NHEJ）及同源重組（Homologous recombination，HR）［10］，從而實(shí)現(xiàn)精確的基因組編輯。本文對(duì)CRISPR/Cas9的基本概況、優(yōu)化及其應(yīng)用等方面進(jìn)行闡述。

1 CRISPR/Cas9的基本概況

1.1 基本結(jié)構(gòu)與作用原理

CRISPR/Cas系統(tǒng)的組成部分是CRISPR序列與Cas基因家族。CRISPR序列由高度保守的順向重復(fù)序列和長(zhǎng)度相近的間隔序列組成，在第1個(gè)重復(fù)序列的上游存在一個(gè)先導(dǎo)序列（leader sequence），它是CRISPR序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的非編碼RNA（CRISPR RNAs，crRNAs）與Cas蛋白一起參與細(xì)胞內(nèi)CRISPR/Cas系統(tǒng)的免疫作用?？茖W(xué)家們?cè)贑RISPR序列位點(diǎn)附近發(fā)現(xiàn)了CRISPR相關(guān)基因（CRISPR-associated gene，Cas gene），并發(fā)現(xiàn)其核心元件序列不一樣，因此，學(xué)者們將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型（表1）［13］。Cas蛋白具有核酸酶功能，可以對(duì)DNA序列進(jìn)行特異性切割，在Ⅰ型、Ⅲ型系統(tǒng)中，負(fù)責(zé)切割的是由多個(gè)Cas蛋白形成的復(fù)合物，在Ⅱ型系統(tǒng)中只用1個(gè)Cas9蛋白可切割DNA雙鏈。Cas9蛋白有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：具有氨基末端的RuvC-like及HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都與DNA的一條鏈結(jié)合，在單向?qū)NA（Single guide RNA，sgRNA）的引導(dǎo)下，通過對(duì)前間隔序列臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM）的識(shí)別來靶定目標(biāo)DNA序列并對(duì)其進(jìn)行切割，形成DSBs。

表1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的類型Table 1 The types of CRISPR/Cas system

CRISPR/Cas系統(tǒng)源于細(xì)菌和古生菌的適應(yīng)性防御，其免疫應(yīng)答反應(yīng)分為3個(gè)階段。第一是獲得階段，噬菌體與外源DNA進(jìn)入細(xì)菌后被識(shí)別結(jié)合到CRISPR陣列中產(chǎn)生免疫記憶后進(jìn)入第二階段——表達(dá)階段，Cas蛋白被表達(dá)，CRISPR陣列被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生crRNA前體（Pre CRISPR RNA，Pre-crRNA），PrecrRNA經(jīng)過反式激活CRISPR RNA（Trans-activating crRNA，tracrRNA）和核糖核酸酶Ⅲ（RibonucleaseⅢ，RNaseⅢ）加工成為成熟的crRNA，最后是干擾階段，當(dāng)噬菌體再次入侵時(shí)，CRISPR/Cas系統(tǒng)在crRNA的引導(dǎo)下Cas蛋白對(duì)噬菌體的基因組和質(zhì)?；蚪M切割形成DSBs。

最初，CRISPR/Cas系統(tǒng)是由Cas蛋白、crRNA和tracrRNA三部分構(gòu)成，主要由crRNA對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行特異性識(shí)別。2012年，Jinek等［14］報(bào)道了Ⅱ型系統(tǒng)切割DNA雙鏈的機(jī)制，對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，使crRNA與tracrRNA整合成一條sgRNA，由此CRISPR/Cas9系統(tǒng)只有sgRNA、Cas9蛋白兩部分。在基因組編輯中，sgRNA與Cas9蛋白結(jié)合后與PAM序列進(jìn)行匹配，從而識(shí)別目標(biāo)基因序列，隨后Cas9蛋白對(duì)靶序列進(jìn)行切割，形成DSBs，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)的NHEJ或HR途徑對(duì)DSBs進(jìn)行修復(fù)，高效地對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯與修飾（圖1）。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)模式圖Fig.1 CRISPR/Cas9 system pattern diagram

1.2 發(fā)展歷史

CRISPR/Cas系統(tǒng)始于1987年CRISPR序列的發(fā)現(xiàn)。1987年，Ishino等［15］科學(xué)家在E.coli中發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，Horvath等［16］在2002年對(duì)嗜熱鏈球菌全基因序列測(cè)序后提出了CRISPR的概念，然而那時(shí)他們并不了解它的功能，猜測(cè)它可能與噬菌體感染的免疫反應(yīng)有關(guān)。到2007年，Barrangou等人［17］最先證明CRISPR序列確實(shí)能夠抵御外來噬菌體的入侵。隨著研究的深入，CRISPR系統(tǒng)的神秘面紗慢慢被揭開。Jinek等［14］在2012年取得重大進(jìn)展，他們將crRNA與tracrRNA整合后形成一條sgRNA以切割DNA，使CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建更加簡(jiǎn)單，到此CRISPR/Cas9系統(tǒng)基本成型［18］。2013年Cong等［19］利用特異性RNA將Cas9帶到靶位點(diǎn)進(jìn)行切割，再加上Mali等［20］發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9經(jīng)過改造后可對(duì)人類細(xì)胞進(jìn)行切割，能使目標(biāo)基因發(fā)生定點(diǎn)突變、定點(diǎn)插入外源基因，基因組的定向編輯技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，同年11月張鋒與珍妮佛·杜德娜聯(lián)合創(chuàng)建了Editas Medicine（EDIT）公司，CRISPR/Cas技術(shù)開始走向市場(chǎng)。2014年，比爾·蓋茨基金會(huì)投資Editas Medicine公司，從此開始了CRISPR研究高潮。

1.3 修復(fù)DSBs的途徑

圖2 DNA修復(fù)途徑Fig.2 DNA repair pathway

修復(fù)DSBs途徑主要有兩種：NHEJ和HR（圖2）。在發(fā)生頻率上，發(fā)生頻率高的是NHEJ途徑，基本上所有的細(xì)胞及G1、S、G2期都能發(fā)生，而HR途徑的發(fā)生頻率極低，主要在S、G2期［21］；但在編輯精確度上，HR途徑比NHEJ途徑高。通過NHEJ途徑，DNA雙鏈重新黏合，在DSB處會(huì)有少量的核苷酸（Nucleotide）插入或刪除（Insertions/Deletions，Indels）。在人工提供同源序列時(shí)，修復(fù)DSBs便是HR途徑，它以同源序列為模板，會(huì)產(chǎn)生精確的定點(diǎn)替換或插入突變體［22］。

1.4 CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

目前通過傳統(tǒng)雜交育種進(jìn)行遺傳改良周期長(zhǎng)，需大量的材料；物理或化學(xué)誘變雖能產(chǎn)生大量的突變位點(diǎn)，但很難掌握突變的方向，導(dǎo)致鑒定不易；RNAi能夠使基因沉默，但是不能穩(wěn)定遺傳。與這些方法相比，基因組編輯技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于：（1）操作簡(jiǎn)單，成本較低，適用于任何物種，目前已在酵母、果蠅、人類細(xì)胞、擬南芥、煙草、玉米、小麥、水稻等多種模式動(dòng)、植物中成功應(yīng)用；（2）效率高，不需要像雜交育種那么長(zhǎng)的周期；（3）精確度高，通過設(shè)計(jì)sgRNA便能特異性識(shí)別目標(biāo)基因的序列，對(duì)任意靶位點(diǎn)進(jìn)行編輯，而T-DNA插入突變等技術(shù)則很難從具有特殊結(jié)構(gòu)的基因中獲得突變體；（4）可通過聚合不同基因至同一區(qū)段，使基因能夠穩(wěn)定表達(dá)；（5）可同時(shí)進(jìn)行多基因編輯，突變不同的靶位點(diǎn)時(shí)只用重新構(gòu)建與靶序列互補(bǔ)的sgRNA，將其與CAS9亞克隆于同一轉(zhuǎn)化載體中即可，大大提高了基因編輯的效率。

2 CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)化

2.1 核心元件的優(yōu)化

CRISPR/Cas9與ZFN、TALEN技術(shù)都存在著脫靶效應(yīng)，目前對(duì)已經(jīng)完成全基因組測(cè)序的作物可以通過在線工具（CasOFFinder、E-CRISPR、CRISPR-P等）預(yù)測(cè)發(fā)生脫靶的位點(diǎn)來選擇合適的技術(shù)（或sgRNA）對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行編輯（表2），但還有很多作物的基因組并未完全測(cè)序，而且對(duì)于某些全基因組中不預(yù)測(cè)的脫靶效應(yīng)還不能通過目前的在線工具進(jìn)行預(yù)測(cè)［23］。

表2 適用于CRISPR/Cas9技術(shù)的在線工具Table 2 The online tools for CRISPR/Cas9 Technology

2.1.1 Cas蛋白的優(yōu)化

對(duì)于Cas蛋白而言，Cas9蛋白識(shí)別PAM序列為NGG，限制了編輯范圍。針對(duì)這點(diǎn)，科學(xué)家們?cè)谄渌镏羞M(jìn)行了Cas蛋白的改造以擴(kuò)大識(shí)別范圍。當(dāng)RuvC結(jié)構(gòu)域上的氨基酸發(fā)生突變時(shí)，如第10位天冬氨酸（Aspartic acid，Asp）突變?yōu)楸彼幔ˋlanine，Ala），會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域失活，不具有切割功能，于是Cas9蛋白只有切口酶的功能，只能切割一條與HNH結(jié)構(gòu)域結(jié)合的鏈，當(dāng)HNH結(jié)構(gòu)域上的氨基酸發(fā)生突變時(shí)，如第840位的組氨酸（Histidine，His）突變成丙氨酸（Alanine，Ala），結(jié)構(gòu)域同樣會(huì)失活，這時(shí)能切割的就是與RuvC結(jié)構(gòu)域結(jié)合的一條鏈，可高效介導(dǎo)外源基因的定點(diǎn)插入，大大降低了NHEJ途徑帶來的風(fēng)險(xiǎn)；當(dāng)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域都發(fā)生氨基酸突變時(shí)，Cas9蛋白就會(huì)變成失活的Cas9蛋白（dead Cas9，dCas9），能通過連接激活子或抑制子對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。經(jīng)過多年的研究，發(fā)現(xiàn)很多SpCas9同源蛋白，如識(shí)別“NNAGAA”PAM序列的嗜熱乳鏈球菌Cas9核酸酶（St1Cas9）［23～25］、識(shí)別“NNGRRT”PAM序列的金黃色葡萄球菌Cas9核酸酶（SaCas9）［26］，擴(kuò)大基因組編輯的范圍。Cas12a蛋白，即Cpf1，它與Cas9蛋白相比區(qū)別在于Cas9蛋白切割形成平末端，Cas12a蛋白切割形成粘性末端，有4～5 nt的粘性凸起，使植物更易以HR方式對(duì)DSBs進(jìn)行精確的替換，Cas12a蛋白的sgRNA更短，提高了Cas12a的打靶效率，且它的脫靶率更低，識(shí)別序列時(shí)TTTN，有利于對(duì)AT含量較高的DNA區(qū)域進(jìn)行打靶。Cas13a蛋白可以在sgRNA引導(dǎo)下識(shí)別RNA并進(jìn)行切割。

2.1.2 sgRNA的優(yōu)化

對(duì)于sgRNA而言，理論上較長(zhǎng)的靶DNA序列會(huì)降低脫靶的概率，然而從Fu等［27］的研究來看，17～19 nt長(zhǎng)的sgRNA比20 nt的sgRNA活性更強(qiáng)、脫靶率更低，當(dāng)sgRNA縮短為15 nt時(shí)則會(huì)失活。2017年Kweon等［28］通過開發(fā)融合向?qū)NA（fgRNA）與Cas9和Cas12a蛋白共同作用以減輕脫靶效應(yīng)，而fgRNA并不會(huì)降低編輯效率。

2.1.3 Cas9蛋白與sgRNA同時(shí)優(yōu)化

對(duì)Cas9蛋白與sgRNA同時(shí)進(jìn)行優(yōu)化，即基因組編輯技術(shù)的新成員——先導(dǎo)編輯（Prime Editing），其同時(shí)具有搜索和替換的功能，能夠介導(dǎo)靶向的插入、缺失和替換。該技術(shù)通過將Cas9切口酶（SpCas9 H840A）與反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse Transcriptase）融合表達(dá)形成Prime Editor（PE），通過使用經(jīng)改造過的gRNA——導(dǎo)向編輯指導(dǎo)RNA（Prime editing guide RNA，pegRNA）實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的編輯。

2.1.4 啟動(dòng)子的選擇

對(duì)于啟動(dòng)子而言，在構(gòu)建CRISPR載體時(shí)通常使用組成型啟動(dòng)子來啟動(dòng)Cas蛋白的表達(dá)，如35S，但此類啟動(dòng)子只會(huì)造成體細(xì)胞基因的編輯，使編輯效率低，因此科研人員研究不同的啟動(dòng)子，包括在生殖細(xì)胞、細(xì)胞分裂活躍的組織中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子（表3）。

表3 啟動(dòng)Cas蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子Table 3 Promoters that activate the expression of Cas protein

2.2 單堿基編輯系統(tǒng)

NHEJ修復(fù)途徑發(fā)生頻率高，但其修復(fù)不精確，通常會(huì)產(chǎn)生少量的Indels產(chǎn)物，而HR修復(fù)途徑雖然比NHEJ途徑精確度高，但是細(xì)胞類型、細(xì)胞周期對(duì)HR途徑的限制很大，而且這兩條途徑相互競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致HR途徑很難高效地產(chǎn)生穩(wěn)定的單堿基突變。在2016年由David Liu課題組開發(fā)了一種新的基因組編輯技術(shù)——堿基編輯技術(shù)（Base editing），實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因組的精準(zhǔn)編輯，使CRISPR/Cas能夠?qū)μ囟▔A基進(jìn)行修改［29，30］。該技術(shù)以CRISPR/Cas系統(tǒng)為基礎(chǔ)，通過dCas蛋白或nCas蛋白與作用于單鏈DNA的脫氨酶結(jié)合來實(shí)現(xiàn)對(duì)靶位點(diǎn)的堿基替換，根據(jù)堿基修飾酶的類型分為胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE）與腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE）兩種，CBE系統(tǒng)與ABE系統(tǒng)分別利用胞嘧啶脫氨酶（Cytosine deaminase，CD）、腺嘌呤脫氨酶（Adenine deaminase，AD）能夠?qū)崿F(xiàn)C-T或A-G的堿基替換（圖3）。單堿基編輯系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在三個(gè)方面：（1）不需要引入DSBs。BE技術(shù)只需dCas蛋白或nCas蛋白即可實(shí)現(xiàn)對(duì)堿基定點(diǎn)替換；（2）與HR途徑相比，BE系統(tǒng)不需提供模板DNA。HR途徑必須在存在同源序列的情況下才能進(jìn)行基因的定點(diǎn)編輯，最重要的是目前很難統(tǒng)一供體DNA的形式以及同源序列的長(zhǎng)度，對(duì)于該怎么將足夠的供體DNA有效地運(yùn)送到細(xì)胞中這一難題也尚未完全解決［31］，因此HR途徑有很多不確定性。但BE系統(tǒng)可直接利用CD或AD通過sgRNA的引導(dǎo)高效實(shí)現(xiàn)C-T或A-G的替換；（3）BE系統(tǒng)的編輯效率高，適用于多種物種上。目前BE系統(tǒng)已經(jīng)在動(dòng)物細(xì)胞、人類細(xì)胞、植物、細(xì)菌等中被廣泛使用［32～35］。

圖3 ABE與CBE系統(tǒng)的工作原理Fig.3 Mechanismsof ABE and CBE system

3 CRISPR/Cas技術(shù)在作物中的應(yīng)用

3.1 水稻

針對(duì)水稻基因的功能及品種改良科學(xué)家們進(jìn)行了很多研究，已有很大的進(jìn)展。2013年，Shan等［36］通過利用經(jīng)過優(yōu)化后的Cas9進(jìn)行原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)OsPDS基因的突變率為14.5%～20.0%，Os-BAHD2、Os02g23823與OsMPK2發(fā)生Indels的比例在26.5%～38.0%，接著對(duì)OsPDS-SP1基因進(jìn)行打靶，用基因槍法對(duì)其胚性愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，共獲得96株轉(zhuǎn)基因植株，其中有9株突變植株，突變率為9.4%，在這9株植株中有3株植株是發(fā)生雙等位基因突變的且具有矮化、白化的特征。Xu等［37］利用兩個(gè)35S啟動(dòng)子與U6-26啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)SpCAS9與sgRNA，針對(duì)水稻BEL利用根癌農(nóng)桿菌侵染胚性愈傷組織，獲得90株轉(zhuǎn)基因植株，其中14例有插入和缺失突變，純合突變體呈現(xiàn)對(duì)苯達(dá)松敏感的表型。Li等［38］利用CRISPR/Cas9技術(shù)特異誘導(dǎo)水稻中Gn1a、DEP1、GS3與IPA1四種基因發(fā)生突變，這些基因分別在籽粒數(shù)、穗結(jié)構(gòu)、粒大小與株型等發(fā)揮調(diào)控作用。對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因植株的表型與效率分析表明，該系統(tǒng)在誘導(dǎo)目標(biāo)基因編輯方面具有很高的效率，分別為27.5%（IPA1）、42.5%（Gn1a）、57.5%（GS3）、67.5%（DEP1），Gn1a、GS3與DEP1突變體的T2代分別具有粒數(shù)增加、粒徑增大、直立穗密集的特點(diǎn)。

3.2 小麥

2014年，Wang等［39］利用TALENs和CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)小麥內(nèi)源基因進(jìn)行改造，以獲得新的能穩(wěn)定遺傳的性狀，他們選擇了3個(gè)MLO位點(diǎn)（TaMLO-A1、TaMLO-b1、TaMLO-d1），為修改3個(gè)TaMLO使用了一對(duì)TALENs（T-MLO），從T0代450株轉(zhuǎn)基因植株中發(fā)現(xiàn)27株突變植株，突變效率為6.0%。接著利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在單個(gè)TaMLO等位基因中誘導(dǎo)突變，使用T7內(nèi)切酶Ⅰ（T7E1）鑒定sgMLO-A1在小麥原生質(zhì)體、植株中誘導(dǎo)的突變，在T0代的72株轉(zhuǎn)基因植株中篩選出4個(gè)獨(dú)立的突變體，突變效率為5.6%，與TALENs獲得的突變效率相似，而且他們還發(fā)現(xiàn)這3個(gè)基因都參與了面包小麥對(duì)Bgt感染的反應(yīng)，這3個(gè)同源等位基因同時(shí)突變使小麥對(duì)白粉病具有廣譜抗性。2017年Zhang等［40］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除TaEDR1基因得到了Taedr1突變體，利用PCRRE鑒定了5個(gè)突變株系（T0-1、T0-2、T0-3、T0-4、T0-5），測(cè)序結(jié)果表明T0-1、T0-2、T0-3三個(gè)基因組都存在移碼突變，對(duì)207株T1植株進(jìn)行PCRRE與測(cè)序分析，僅鑒定出5個(gè)純合T1突變體（3個(gè)來自T0-2，2個(gè)來自T0-3）具有移碼突變，與野生型相比，其白粉病微菌落少和易感性降低，由此可見其對(duì)白粉病的抗性增加。

3.3 番茄

2015年，由于缺乏有效的方法將DNA修復(fù)模板傳遞給植物細(xì)胞，使用HR途徑修飾植物基因組一直是個(gè)挑戰(zhàn)。ˇCermák等［41］使用雙生病毒復(fù)制子對(duì)番茄基因組進(jìn)行遺傳修飾，其頻率比傳統(tǒng)的DNA傳遞方法（農(nóng)桿菌）高10倍。他們?cè)诜训幕蚪M中，在ANT1的啟動(dòng)子區(qū)和基因編碼區(qū)之間設(shè)計(jì)了TALEN或CRISPR/Cas9位點(diǎn)，提供模板DNA，包括兩個(gè)同源臂，即ANT1的啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)，還添加了Nos的啟動(dòng)子區(qū)、抗生素基因的編碼區(qū)、35S終止子區(qū)和35S啟動(dòng)子，因此TALEN或CRISPR進(jìn)入基因組對(duì)其位點(diǎn)進(jìn)行切割后啟動(dòng)植物HR修復(fù)機(jī)制，使模版DNA插入到基因組上，即在表達(dá)抗生素基因后還插入了一個(gè)35S強(qiáng)啟動(dòng)子基因，使原本由內(nèi)源啟動(dòng)子啟動(dòng)的ANT1變成由35S啟動(dòng)，增加了ANT1的表達(dá)，得到花青素含量高的果實(shí)。2017年，為了研究SlMAPK3基因?qū)Ω珊得{迫的響應(yīng)，Wang等［42］使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除該基因獲得slmapk3突變體，在干旱脅迫下，與野生型相比其萎蔫更嚴(yán)重、更高的H2O2含量、更低抗氧化酶活性以及更多的膜損傷，此外，敲除基因?qū)е赂珊得{迫應(yīng)答基因Sl-LOX、SlGST、SlDREB的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，證明Sl-MAPK3通過保護(hù)細(xì)胞膜免受氧化損傷和調(diào)節(jié)脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄參與番茄植株的干旱反應(yīng)，具有抵抗干旱的能力。2018年，Li等［43］利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)5個(gè)基因，即在SP編碼區(qū)、SP5G編碼區(qū)、CLV3啟動(dòng)子區(qū)、WUS順式調(diào)控元件及GGP1開放閱讀框上游進(jìn)行編輯，這5個(gè)基因分別調(diào)控植株的株型、開花時(shí)間、果實(shí)大小及維生素C含量，將理想性狀導(dǎo)入4份耐逆野生番茄材料中，發(fā)現(xiàn)馴化后的番茄植株株型變得緊湊，開花時(shí)間提前，果實(shí)變大、維生素C含量上升，且保持了親本的抗病性與耐鹽性。

3.4 黃瓜

2016年，Chandrasekaran等［44］利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)黃瓜的病毒抗性進(jìn)行研究，以elF4E基因的N0與C0末端為靶位點(diǎn)構(gòu)建了Cas9/sgRNA載體對(duì)該基因進(jìn)行敲除，結(jié)果表明純合T3代植株對(duì)黃瓜葉脈黃化病毒感染具有免疫力，對(duì)西葫蘆黃化花葉病毒、木瓜環(huán)斑鑲嵌病毒具有抗性，而雜合突變體與非突變體對(duì)這些病毒高度敏感，說明elF4E基因在黃瓜中具有廣譜的抗病毒能力。2017年，戚晶晶等［45］利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了CsVFB1基因，經(jīng)單克隆測(cè)序后在21個(gè)有效單克隆中檢測(cè)到4個(gè)突變，成功獲得轉(zhuǎn)基因矮生黃瓜T0代植株，突變效率為19.05%。2018年，楊麗等［46］對(duì)CRISPR/Cas9載體進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)CsVFB1、CsMLO8、CsGAD1基因進(jìn)行編輯，發(fā)現(xiàn)T0植株編輯效率為100%，提高了黃瓜CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將CsWIP1基因敲除，從后代中篩選出純合突變體Cswip1，使雌雄同株轉(zhuǎn)化為全雌株，創(chuàng)制了黃瓜全雌系種質(zhì)材料。

4 展望

自SSNs被發(fā)明，在這十多年的時(shí)間里基因組編輯技術(shù)發(fā)生了翻天覆地的變化，CRISPR/Cas9技術(shù)極大地加快了對(duì)作物基因功能的研究速度，同時(shí)也能作為一種新型育種技術(shù)（Newbreedingtechniques，NBTs）對(duì)作物品種進(jìn)行改良，然而CRISPR/Cas9技術(shù)還面臨著很多問題亟待解決。

首先是脫靶問題。CRISPR/Cas9技術(shù)在植物中發(fā)生的脫靶可以通過后代的分離而消除，若能消除脫靶，對(duì)其發(fā)展則有十分深遠(yuǎn)的影響。本文中提到了多種方法可以提高其特異性，比如對(duì)Cas蛋白進(jìn)行優(yōu)化等。

第二，提高編輯效率。首先，針對(duì)DNA修復(fù)途徑來提高編輯效率，不同物種、細(xì)胞類型發(fā)生HR途徑頻率有很大的區(qū)別。（1）細(xì)胞周期的同步化。HR途徑主要發(fā)生在S、G2期，NHEJ途徑主要發(fā)生在G1、S、G2期，細(xì)胞周期不同所選擇的修復(fù)方式也不同，可通過對(duì)細(xì)胞周期同步化后再進(jìn)行基因組編輯。（2）供體DNA的優(yōu)化。通過優(yōu)化供體DNA的數(shù)量、長(zhǎng)度、類型、導(dǎo)入方式，可提高HR途徑效率。如Baltes等［47］利用煙草為研究材料，使用雙生病毒載體表達(dá)SSNs與DNA模板，與T-DNA載體相比，HR途徑效率有了很大提高。其次，針對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，如核心元件的優(yōu)化。

最后，各國(guó)政府對(duì)基因編輯作物的監(jiān)管問題。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展，越來越多的學(xué)者利用其進(jìn)行品種改良，能夠?qū)⑿枰獛啄晟踔潦菐资甑臅r(shí)間縮短至幾個(gè)月，更重要的是CRISPR/Cas9技術(shù)能夠獲得理想的特性并將其穩(wěn)定遺傳給后代，但是這樣所獲得的基因編輯作物會(huì)給世界帶來什么樣的結(jié)果還一無所知，人們對(duì)此十分關(guān)注。目前各國(guó)政府對(duì)轉(zhuǎn)基因生物（Genetically modified organisms，GMOs）主要有兩種監(jiān)管態(tài)度［48］：（1）以歐盟為代表的基于過程的監(jiān)管（Process-based），基因重組技術(shù)被認(rèn)為具有潛在的危險(xiǎn)性。無論通過這項(xiàng)技術(shù)獲得什么基因或生物，只要有外源DNA轉(zhuǎn)入，哪怕最終體內(nèi)不存在外源DNA，都需要進(jìn)行安全性評(píng)估與監(jiān)測(cè)；（2）以美國(guó)為代表的基于產(chǎn)品的監(jiān)管（Productbased），認(rèn)為GMOs與非轉(zhuǎn)基因生物（Non-genetically modified organisms，Non-GMOs）之間沒有本質(zhì)區(qū)別，需要監(jiān)管的是生物技術(shù)的產(chǎn)物，而不是技術(shù)本身。相比較而言，過程監(jiān)管要比產(chǎn)品監(jiān)管更嚴(yán)格。美國(guó)農(nóng)業(yè)監(jiān)管機(jī)構(gòu)認(rèn)為，基因編輯作物（Genome edited crops，GECs）是通過激活細(xì)胞中的DNA修復(fù)機(jī)制而產(chǎn)生的突變，類似于自然突變、物理化學(xué)誘導(dǎo)突變，不屬于GMOs。2016年，楊亦農(nóng)教授通過CRISPR/Cas9技術(shù)培育的白蘑菇經(jīng)過批準(zhǔn)可不受監(jiān)管，成為第一個(gè)脫離監(jiān)管的GEC。到目前為止，美國(guó)農(nóng)業(yè)監(jiān)管機(jī)構(gòu)已經(jīng)確定了至少5種GECs不屬于GMOs，包括ZFNs技術(shù)創(chuàng)造的低植酸玉米品種、TALEN技術(shù)創(chuàng)造的耐冷藏馬鈴薯品種及高油酸、低亞油酸大豆，以及CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)造的抗褐化雙孢菇和抗除草劑玉米［49］。由于受多種因素的影響，歐盟對(duì)待GMOs的態(tài)度十分謹(jǐn)慎，對(duì)待轉(zhuǎn)基因及基因編輯等NBTs的態(tài)度也十分保守，導(dǎo)致其產(chǎn)業(yè)格局以及產(chǎn)品的開發(fā)落后于美國(guó)等國(guó)家。中國(guó)國(guó)務(wù)院發(fā)布的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》明確指出，農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物是指利用基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)或農(nóng)產(chǎn)品加工的動(dòng)植物、微生物及其產(chǎn)品。然而目前對(duì)于GECs的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)沒有明確的規(guī)定，對(duì)其的監(jiān)管態(tài)度也沒有相關(guān)的報(bào)道。盡管基因組編輯技術(shù)只出現(xiàn)十幾年，但對(duì)農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)的影響十分重大，目前全球基因組編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)格局逐漸成形，我國(guó)基因組編輯技術(shù)位于世界前列，針對(duì)我國(guó)國(guó)情及基因組編輯技術(shù)研究進(jìn)展制定合理的法規(guī)對(duì)正確引導(dǎo)我國(guó)基因組編輯技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用至關(guān)重要。

綜上所述，CRISPR/Cas9技術(shù)在基因功能分析、植物分子育種、人類疾病靶向治療等方面具有無限潛力，雖然存在著一些問題，但是隨著更多研究人員對(duì)該技術(shù)深入研究會(huì)使其逐漸完善，希望我國(guó)能在夯實(shí)現(xiàn)有基礎(chǔ)上再向前一步，形成我國(guó)基因組編輯技術(shù)應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)領(lǐng)域，鼓勵(lì)創(chuàng)新，發(fā)展具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因組編輯技術(shù)，爭(zhēng)取在該領(lǐng)域中的主動(dòng)權(quán)和話語權(quán)。